大肠菌群测定

1、6/6大肠菌群测定定义大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数以10m（g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：。2。2恒温培养箱：361.2.3恒温水浴锅：46。2。 显微镜:110。 均质器.26 电子天平：感量.。无菌吸管：1m（具001ml刻度)、10l（具0.1ml刻度).2。8无菌锥形瓶：容量50ml、250。2.9 灭菌玻璃珠：直径约5mm.2.1

2、0无菌平皿：直径90。2.1灭菌试管：16mm160 mm。12 灭菌刀、剪子、镊子等.3 培养基和试剂3.1 乳糖胆盐发酵管及双料乳糖胆盐发酵管：见附录中.32 伊红美蓝琼脂平板：见附录中.3。3乳糖发酵管:见附录中4。4 操作方法4.1 试验前准备。1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管(ml、1ml)、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。412 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。4。1。 操作人员用肥皂洗手,关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间,换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。1

3、操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围,待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。4.2 样品稀释液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备样品稀释液。样品稀释液制备若需用水浴加温时,温度不应超过.样品稀释液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。以无菌操作将检样25g（ml)放于含有225l灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以800/mi100rmin的速度处理1min，做成l：10的均匀稀释液.4。3 大肠菌群测定。3.1 用1l无菌吸管或

4、微量移液器吸取1：0样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：10的样品匀液。4。32 按4。31操作程序，制备0倍系列稀释样品匀液.每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。4.33 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度，接种三管.4.3.乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管，1m及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置1温箱内，培养4 h2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气

5、，则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行.4。35 分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36温箱内，培养18h2h,然后取出,观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。4。3.6 证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1个个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置6培养箱内培养24h2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告力大肠菌群阳性。43。7 报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表,报告每l00m(）大肠菌群的MP值。大肠菌群最可能数（MN）检索表阳性管数MP100l（g）95可信限ml（g）30.1ml(g)30。

6、01ml(g)3下 限上限0003001359026000390030513001600129003102012212002310030903110321603190104052001010021021101031501071023011110303612150113901011030301211501203240大肠菌群最可能数(MPN)检索表（续)阳性管数MN00ml（)9%可信限l（g）30。ml（g）30。0m（g）下限上限1306013120012401332020090103021403037020222060210150304021127082122721402202004221

7、28010010022350223402320313623244233002304012301390130030264050383501430721003175002300312003080131603209301508003150030044032221003570323003024060130003314600700033200150040003332400注1：本表采用3个稀释度1ml(g)、.1ml（）和0.1ml（g)，每稀释度三管。注2：表内所列举样品量如改用10（g)、1ml（g）和0。ml（）时,表内数字应相应降低10倍;如改用01ml（g）、0.m（g)和01ml(g）时，则

8、表内数字应相应增加10倍。其余可类推。附录 培养基和试剂1 乳糖胆盐发酵管1。1 成分蛋白胨 g猪胆盐（或牛、羊胆盐）g乳糖10g0。04溴甲酚紫水溶液 25ml蒸馏水 000mp 412 制法将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正，加入指示剂，分装每管10ml，并放入一个小倒管,115高压灭菌15m.注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外,其他成分加倍.2 伊红美蓝琼脂(E）2。1 成分蛋白胨10g乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂17g2伊红Y溶液 2ml.65美蓝溶液 10ml蒸馏水 100lp 7.12.2制法将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，11高压灭菌15in备用.临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至55,加入伊红