蛋白质复性方法

1、包涵体表达的蛋白的复性摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、 包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因 素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用 而提高了蛋白质复性产率。关键词 包涵体 蛋白质 复性Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields w

2、ere included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules.Key words inclusion body , protein , renaturation外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包 涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、 抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白 质的复性率一般都很低，而分子伴侣、低分子量 添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法

3、 的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。一、 包涵体：包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒 素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状 或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等，大小 为，具有很高的密度（约 ml）,无定形，呈非水 溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸服等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级 结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的 作用。1包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些 蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成 正确的次级键等

4、原因形成的。基因工程菌的表达产率过高，超过了细 菌正常的代谢水平，由于细菌的6因子的蛋白水 解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究 发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越 容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以 至于没有足够的时间进行折叠， 二硫键不能正确 的配对，过多的蛋白间的非特异性结合， 蛋白质 无法达到足够的溶解度等。重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨 基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显 与包涵体的形成呈正相关。重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞 内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于 缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因 子

5、，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积 累，容易形成包涵体沉淀。蛋白质在合成之后，于中性 pH或接近 中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包 涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很 高，如Aspartase和Cyanase表达产率达菌体蛋 白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。2在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间 的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包 涵体的形成。包涵体破菌、分离、洗涤及溶解基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用： 机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模 下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递 和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的 破碎，这样

6、部分未破碎细胞与包涵体混在一起， 给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时 先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎 方法，可显着提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解 ，然后以5000-20000g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性 蛋白分离。洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质， 如 膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用 低浓度的变性剂，过高浓度的尿素或盐酸服会使 包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100 洗涤去除膜碎片和膜蛋白。3溶解：一般用强的变性剂如尿素(6-8M)、 盐酸月瓜

7、(GdnHCl 6M),通过离子间的相互作用， 打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学 键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸服优于尿素， 因为盐酸肌是较尿素强的变性剂， 它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氟酸盐 能导致多肽链的自由氨基甲酰化， 特别是在碱性 pH值下长期保温时。或用去垢剂，如 SDS正 十六烷基三甲基俊氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula Suntha 等人用 TritonX-100 来溶解 Zymononas mobilis levansucrase 包涵体蛋白。另 外，对于含有半胱氨酸的蛋白质， 分离的包涵体

8、 中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非 活性二硫键。还需加入还原剂，如疏基乙醇、二 硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤薛糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM 2-BME或 DTT,也有文献使用 5mM浓度。在较粗放的条 件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓 度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键 的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵 体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体 的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。4二、复性：由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因 此重组

9、蛋白的复性特别必要。通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到 正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常 形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始， 到2M左右时结束。对于盐酸服而言，可以从4M 开始，到1.5M时复性过程已经结束。包涵体蛋白复性方法稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过 夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快， 不易控制。目前稀释法主要有一次稀释、 分段稀 释和连续稀释三种方式。透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐 降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称 易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操 作，无法应用到生产规模。超滤复性：在生产中较多的使用，规模

10、较 大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样 品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中 不可逆的变性。柱上复性：是最近研究较多并成功的在生 产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶 柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用 Sephacry1S-100或 Superdex75 等分子筛填料，柱 较长（40cm-100cm不等）。相比稀释和透析两种 方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右） 5高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方 法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入 到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程

11、中或加 入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠 复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的 中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质 折叠复性。止匕外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都 可用蛋白质的复性。包涵体蛋白复性效率复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性 的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身 的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰 RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有 发现能够对其进行复性的方法如IL-11,很多蛋白的复性效率只有百分之零点几，如在纯化IL-2时以十二烷基硫酸钠

12、溶液中加入铜离子(SDmol/l CuCl2)的方法，25-37 C下反应3小时，再 EDTA至1m mol/l终止反应，复性后的二聚体低 于1%。6一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素：蛋白质的复性浓度：正确折叠的蛋白质 的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用，蛋 白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素，因而， 一般浓度控制在 ml;如果变性蛋白加入复性液 中过快，容易形成絮状沉淀，可能是蛋白重新凝 聚的缘故。所以我们采用再水浴和磁力搅拌下， 逐滴加入变性蛋白，使变性蛋白在复性液中始终 处于低浓度状态。pH和温度：复性缓冲液的 pH值必须在 以上，这样可以防止自由硫醇的质子

13、化作用影响 正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复 性效率，最适宜的复性pH值一般是。12此外，影响复性效率的因素还有，变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、 共溶剂和其他添加剂的存在与否等。提高包涵体蛋白的复性产率氧化-还原转换系统对于含有二硫键的蛋白，复性过程应能够促使 二硫键形成。常用的方法有：空气氧化法、使用 氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化 法及DTT再氧化法.最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG而 cysteine/cystine 、 cysteamine/cystamine 、 DTT/GSSG DTE/GSS常也都有应用。氧化交换 系统通过促使不正

14、确形成的二硫键的快速交换 反应提高了正确配对的二硫键的产率。通常使用 1-3m mol/l还原型疏基试剂，还原型和氧化型疏 基试剂的比例通常为10: 1 5: 1。7添加低分子化合物低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠， 但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增 加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复 性产率。如盐酸月瓜、胭、烷基胭、以及碳酸酰胺 类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂。蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用，如蛋白质的辅因子2伊或C/可以稳定蛋 白质的折叠中间体，从而防止了蛋白质的聚集， 加入浓度大于mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋 白质的折叠效率。浓度

15、为-0.6M L-Arg有助于增加 复性中间产物的溶解度。成功的应用于很多蛋白 如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。NDSBs是近年来出现的可促进蛋白复性的新家 族，NDSBs由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短的 疏水集团组成，故不属于去垢剂，不会形成微束， 易于透析去除，目前，常用的有NDSB-195,NDSB-201, NDSB-25& 8PEG-NaSO 两相法用PEG?口 NaSQ作为成相剂，然后加入盐酸服， 再把变性的还原的蛋白质溶液加入其中进行复 性，但这种方法需复性的变性蛋白质的浓度必须 低。9分子伴侣和折叠酶等这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白二硫键异构 酶、肽酰-辅氨酰顺反异构酶

16、、分子伴侣、FK506 结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶等 不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程 的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。132.2.2.5 其它提高复性率的策略还有许多，如：非离子型去 垢剂，尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活 性齐CHAPs Triton X-100、磷脂、laury Imaltosid、 Sarkosyl等对蛋白质复性有促进作用；待折叠复 性的蛋白质的抗体可有效协助其复性；多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的作用，而且具有稳定天然蛋白质的作用。10 复性效果的检测：根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免 疫、物理性质等方面

17、对蛋白质的复性效率进行检 测。凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯 酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白 质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键 的蛋白复性后二硫键的配对情况。光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光 光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下 的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用 于复性研究中的过程检测。色谱方法：如 IEX RP-HPLC CE 等,由于两种状态的蛋白色谱行为不同，生物学活性及比活测定：一般用细胞方 法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白 的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的 结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。黏度和浊度测定：复性后的

18、蛋白溶解度 增加，变性状态时由于疏水残基暴露， 一般水溶 性很差，大多形成可见的沉淀析出。免疫学方法：如 ELISA WESTERN等， 特别是对结构决定簇的抗体检验， 比较真实的反 映了蛋白质的折叠状态。11在正常的生理条件下，组成蛋白质的多肽链都 能以独特的方式进行折叠，形成自己特有的空间 结构，以执行某一些生命活动。当外界环境改变 时，可能造成基因突变和蛋白质序列改变，错误剪接和运输，错误折叠和异常聚积，形成对机体 有害的反应，引起构象病的发生和无生物活性、 不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性 过程中发生聚集的机制尚不清楚， 许多已建立的 高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建

19、 立的，且没有普遍性，但从这许许多多的个例中 发现了一些规律：如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间 体可能具有不同的作用等等，并利用这些知识建 立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相 关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将 来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。参考文献1包涵体蛋白质的复性研究进展宁云山李妍生物技术通讯2重组包涵体蛋白质的折叠复性冯小黎生物化学与生物物理进展2001;28(4)3 Fischer B, Sumner I. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in as inclusion bodies. Biotech Bioeng,1993,41(1)4王克夷哇命的化学,1999,19(5)5 Werner M H, Clore G M, Refolding proteins by gel filtration chromatography. FEBS Lett, 1994,3