实验二十五基因重组实验Ⅳ-重组体的筛选与鉴定

1、PAGE PAGE 11实验二十五 基因重组实验重组体的筛选与鉴定 原理 限制性内切核酸酶酶切鉴定：具体原理见实验二十一。PCR反应应鉴定：具体原原理见实实验十八八。试剂1、DNAA模板2、引物3、Taqq DNNA聚合合酶4、dNTTPs（ddATPP、dGGTP、ddCTPP、dTTTP）5、10PCRR 反应应缓冲液液：1000mmmol/L TTriss-HCCl ppH 88.3，5500mmmoll/L KCll，155mmool/LL MggCl22，0.1%明明胶6、矿物油油超纯水8、EcooR II酶解反反应液（110）: 1mool/LL pHH7.55 TTriss-HC

2、Cl , 0.5mool/LL NNaCll , 0.1mool/LL MMgCll2 。9、Hinnd IIII酶酶解反应应液（110）：1mmol/L ppH7.4 TTriss-HCCl , 1moll/L NaaCl , 0.007mool/LL MMgCll2 。3.50TAEE 电泳泳缓冲液液：称取取2422克Trris，加加入577.1mml冰乙乙酸，1100mml 00.5mmol/L EEDTAA，调节节pH至至8.00，加蒸蒸馏水至至10000mll。10、.凝凝胶加样样缓冲液液：0.25%溴酚蓝蓝、0.25%二甲苯苯青FFF、400%蔗糖糖水溶液液（w/v）。11、1%（

3、1.5%）琼琼脂糖凝凝胶：11TAEE 1000mll含1gg（1.55g）琼琼脂糖。器材1、DNAA扩增仪仪2、电泳仪仪、电泳泳槽3、微量移移液器4、紫外投投射仪5、0.55ml塑塑料离心心管6、样品槽槽模板（梳梳子）7、锥型瓶瓶（1000mll或500ml）8、一次性性塑料手手套9、凝胶成成像系统统操作步骤骤1. 酶酶切反应应体系的的建立（220l反应应体系） 按下下表要求求配制酶酶切反应应体系质粒DNAA6l10Buuffeer2lHindIIII1lH2O10lEcoR I1l 混匀匀后置337水浴33h。2. PPCR反反应体系系的制备备(255l反应应体系)按下表要求求配制酶酶切反

4、应应体系DNA2l 10Buuffeer2.5lldNTP0.1ll H2O17.2lPrimeer-110.1llTaqE1lPrimeer-220.1ll50%甘油油2l混匀后，220000rpmm离心330seec，然然后按 944 5miin 944 40ssec 555 40ssec 335cyyclees 722 90ssec 722 3miin3. 电泳泳：1%琼脂糖糖凝胶（酶酶切）和和1.55%琼脂脂糖凝胶胶（PCCR反应应）将20ll酶切和和PCRR产物进进行电泳泳，观察察结果。Vocabbulaary in Bioocheemiccal tecchnoologgyAAbso

5、rrbannce 吸光度Absorrbennt吸附剂Absorrptiion chrromaatoggrapphy吸附层析Absorrptiion speectrrum吸收光谱Acryllamiide, Aaa/Accr丙烯酰胺（单单体）Adeniine, A腺嘌呤Affinnityy chhrommatoograaphyy亲和层析Agaroose琼脂糖Agaroose gell ellecttropphorresiis，AAGE琼脂糖凝胶胶电泳Allelle sspeccifiic ooliggonuucleeotiide, ASSO等位基因特特异性寡寡核苷酸酸杂交Ammonniumm pe

6、ersuulfaate, APP过硫酸胺Anglee rootorr角式转头Anionn exxchaangee chhrommatoograaphyy阴离子交换换层析CCarriier ampphollytee载体两性电电解质Catioon eexchhangge cchroomattogrraphhy阳离子交换换层析Celluulosse aacettatee meembrranee ellecttro -phhoreesiss，（CCAMEE）醋酸纤维薄薄膜电泳泳Celluulosse iion-excchanngerrs纤维素离子子交换剂剂Centrrifuuge离心机Centrrif

7、uugall foorcee离心力Centrrifuugall teechnniquue离心技术Coenzzymee辅酶Colummn cchroomattogrraphhy柱层析Cytossinee, CC胞嘧啶DDenatturee grradiientt geel eelettro -phhoreesiss , DGGGE变性梯度凝凝胶电泳泳Deoxyyribbonuucleeic aciid, DNAA脱氧核糖核核酸Dialyysiss透析Diffeerenntiaal ccenttriffugaatioon差速离心Discoontiinuoous PAGGE不连续聚丙丙烯酰胺胺凝胶电

8、电泳EEletrro-oosmoosiss电渗Emisssionn sppecttrumm发射光谱Excluusioon cchroomattogrraphhy排阻层析GGel cchroomattogrraphyy凝胶层析Gel ffilttrattionn凝胶过滤Guaniine，GG鸟嘌呤HHomoggeniizerr匀浆器Holozzymaase全酶IIon-eexchhangge cchroomattogrraphhy离子交换层层析Ion-eexchhangge ggel离子交换凝凝胶Ion-eexchhangge rresiin离子交换树树脂Isoellecttricc foocu

9、ssingg, IIEF等电点聚焦焦Isoennzymme同工酶LLigannd配基MMeltiing temmperratuure, Tmm溶解温度Matriix载体Mobille pphasse流动相Molecculaar ssievve ffilttrattionn分子筛过滤滤NN,N,NN,NN-meethyylennc Bisaccryllamiide , BissN,N,NN,N-四亚甲甲基 双双丙烯酰酰胺N,N,NN,NN-ttetrrameethyyletthylleneedi -amminee, TTEMEED四甲基乙二二胺OOsmossis渗透PPaperr chhromm

10、atoograaphyy纸层析Partiitioon cchroomattogrraphhy分配层析Partiitioon ccoeffficciennt分配系数Photooeleectrric colloriimettry光电比色法法Plasmmid质粒Polyaacryylammidee geel eelecctroophooressis, PAAGE聚丙烯酰胺胺凝胶Polymmeraase chaain reaactiion, PCCR聚合酶链反反应Primeer引物RRelattivee ceentrrifuugall foorcee, RRCF相对离心力力Restrricttionn

11、 enndonnuclleasse ，RRE限制性内切切酶Restrricttionn frragmmentt leengtth ppolyymorrphiism, RFFLP限制性片段段长度多多态性Rate zonnal cenntriifuggatiion速率区离心心法Reverrse osmmosiis反向渗透Revollutiion perr miinutte ,rpmm每分钟转速速Ribonnuclleicc accid, RNNA核糖核酸Rotorr转头SSaltiing in盐溶Saltiing outt盐析Saphaadex葡聚糖凝胶胶SDS-PPAGEESDS-聚聚丙烯酰酰胺

12、凝胶胶Sedimmenttatiion coeeffiicieent 沉降系数Sedimmenttatiion vellociity沉降速率Sedimmenttatiion timme,SST沉降时间Sephaarosse琼脂糖凝胶胶Sequeenciing测序Singlle sstraand connforrmattivee poolymmorpphissm, SSCCP单链构象多多态性Sodiuum ddodeecyll suulfaate, SDDS十二烷基硫硫酸钠Specttropphottomeeterr分光光度计计Specttropphottomeeterry分光光度法法Statiionaary phaase固定相Swingg-ouut rrotoor水平式转头头TThin-layyer chrromaatoggrapphy, TLLC薄层层析Transsmitttannce透光率Thym