感受态细胞的制备

1、LB液体培养基：胰蛋白胨，1%（W/V）；酵母提取物，0.5%（W/V）；NaCl,1%（亚/丫），用固体NaOH调节pH为7.07.2,分装于三角瓶中，灭菌后存于室温。摇动三角瓶，如果发现变浑浊，表明已染菌，应弃掉重新配制；0.1mol/LCaCl2：称取1.47gCaCl22H20（Amresco分装）溶于100mL去离子水中，灭菌后存于4；离心管（50mL或80mL或100mL），灭菌；培养试管，灭菌；1mL枪头，灭菌；1mL加样枪；滤纸，用牛皮纸包好后灭菌；10mL量筒，灭菌；5mL移液管，用棉花塞入管口，卷于报纸中灭菌；冰，离心管架；恒温摇床，可见分光光度计，玻璃比色杯。.接种空白大

2、肠杆菌于3mLLB培养基中，37剧烈震荡培养过夜；.将已培养好的种子液转入100mLLB培养基中扩大培养至OD650=0.3后，将培养好的细菌置于冰上冷却10min；.4,4000rpm离心10min收集细菌，倒出上清，将离心管倒置于一干净滤纸上，将培养基控干；.用40mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌，用加样枪冲吸，使菌体尽可能分散。冰上放置30min；.4,4000rpm离心10min收集细菌，倒出上清，再用4mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌，这些细菌可以立即使用，或者于4放置1224h以增加其敏感性后使用。.如果证明所制备的感受态细胞可用，可以在冰上分装为100L每管，再加入100L甘油（注意

3、：甘油非常黏稠，吸取时应该多一点。），于液氮或-70冰箱中存放。存于低温下的感受态细胞，一定不能融解。如果已经融解，应丢弃，而不能再冻结保存而继续使用。.本实验室所用空白大肠杆菌菌株为1乂109。空白菌可以于平板上划线后，用Parafilm包好后存于4,也可将液体培养物存于4。但如果要长期保存，则应将细菌保存于50%的甘油中，存于-20或-70。当接种的细菌是来自于-20或-70存放的液体培养物时，接种应迅速，不等解冻，立即从表面刮下一块冰后，将菌种迅速放回低温存放；.一般于3mLLB培养基中过夜培养12h后，菌体已很浓，可以进行扩大培养。于100mL培养基中培养23h后，即可达到对数生长期。

4、但有时如果由于存放过久，或者已经过数次解冻，造成细菌生活力下降，则倍增时间会延长；.对OD值的监测，当肉眼看到菌体已很浓时，于超净台上取3mL测OD值。开始可以每30分钟检测一次，越到后面检测的时间就应该缩短；.感受态细胞的制备应该再严格无菌的条件下进行。因此，所有操作均应在超净台上。也可以在实验台上进行，但应在后面放一酒精灯，所有操作都不能远离火焰。最好每次恰好做感受态之前，将所有的枪头和管子都灭一下菌，用酒精棉球将加样枪的前端擦拭一遍；.感受态细胞的细胞膜比较脆弱，因此一当用冰冷的CaCl2悬浮以后，即不能剧烈震荡或快速抽吸；.根据我们的经验，纯度较高的含结晶水的CaCl2可以得到好的实验

5、结果；.所有的枪头和管子均应干净。如果有可能，都尽量用新的。如果是用的回收的枪头，一定要看管壁是否干净。.扩大培养用的液体培养基体积可以调整。调整后的CaCl2溶液体积也按比例作相应的放大或缩小。.以本方法制备的感受态细胞的感受效率将随低温保存时间的延长而下降，所以最好是现做现用。存于低温下的感受态细胞应该在一个月内使用。而对于转化PCR连接产物，建议用其它的感受效率更高的制备方法。本节后的附4介绍了一种高感受效率感受态细胞的制备方法。质粒DNA的转化LB液体培养基：见感受态细胞的制备；LB固体培养基：于液体培养基中加入1.5%的琼脂粉。不用在灭菌前溶化琼脂粉，灭菌完后，轻轻摇匀。注意不能剧烈

6、摇动，否则可能会使培养基暴沸；LB平板:将灭菌后的固体培养基冷至60左右时，倒入90mm的培养皿中（约30mL。如果先前已加入了抗生素，则还应在超净台上晃动培养皿几次；200L枪头，1.5mLEp管，灭菌；42水浴；10L，200L加样枪；培养试管，灭菌；恒温摇床，恒温培养箱；菌液推棒；抗生素储液，本实验室所有的质粒筛选所用的抗生素有两类，氨卞青霉素（Amp）（储液，100mg/mL，溶于无菌水中，工作浓度100g/mL，即每毫升培养基取1L储液）；四环素（Tet）（储液，5mg/mL，先用1/2体积的乙醇溶解，再加入1/2体积的无菌水，工作浓度50g/mL，即每毫升培养基取10L储液。储液全

7、部于-20保存）；冰；1如果是冻存的感受态细胞，先于冰上溶解；.加入用于转化的质粒A1L；3冰上放置30min；.于42热击60s；.迅速放于冰上，5min后进行下一步；.将已摄取了外源遗传物质的感受态细胞加入培养试管，该培养试管有已预热至37的LB液体培养基，使总体积为1m，温和震荡（200rpm左右）培养1h；7,将复苏的培养物倒入一Ep管中，4，4000rpm离心10min，将培养基倒掉，用残留的培养基悬浮，然后用加样枪将菌液加到LB平板上，用推棒涂布直至培养基表面无可见的液体，将有培养基的一面向下培养约30min后，倒置培养过夜。1热击时间要根据所用管子的传热效率，薄壁管子的传热效率高

8、，热击时间可以缩短到45s；2热击时，要使水浴尽可能不要流动，热击后应迅速放回冰上；3于37复苏细菌时，不能加抗生素，摇动也不能太过于剧烈；4.对照的设置对于评价转化结果非常重要，将10L感受态细胞分别涂布于不含抗生素或含有抗生素的平板上，如果感受态细胞没有问题，则应该在不含抗生素的平板上生长，而在含有抗生素的平板上不能生长。5一般转化细胞可以用其中的1/3涂布一个平板，2/3涂布一个平板。不过，对于多拷贝质粒，也可以不用离心，取50L涂布一个平板足矣。质粒DNA的提取储液：100mL1mol/LTris-HCl(pH8.0):称取Tris12.1g,用浓HCl调节pH为8.0,然后定溶至10

9、0mL,灭菌后存于4；100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)称取18.6g二水乙二胺四乙酸二钠，加80mL去离子水，加热溶解，用固体NaOH调节pH为8.0,然后定溶至100mL,灭菌后存于4；100mL10%SDS,称取10g十二烷基硫酸钠于80mL去离子水中，加热溶解后存于室温;2mol/LNaOH10mL,称取0.8g固体NaOH溶解，定溶至10mL,于塑料瓶中室温存放,可以不灭菌。溶液I：每配制100mL,称取葡萄糖0.9g(50mmol/L),1mol/LTris-HCl(pH8.0)2.5mL(25mmol/L),0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL(10mmol

10、/L),定溶至100mL,灭菌后存于4；溶液II：现用现配，每100L需要2mol/LNaOH10L(0.2mol/L),10%SDS10L(1%),然后加80L无菌水；溶液III：每100mL称取KAc49.1g,于70mL去离子水中溶解，然后加入冰乙酸11.5mL,定溶至100mL后，灭菌存于4；TE(pH8.0)：每100mL取1mol/LTris-HCl(pH8.0)储液1mL(10mmol/L)，0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL(1mmol/L)定溶至100mL后，灭菌存于4；无DNase的RNaseA：WRNaseA溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)

11、,15mmol/LNaCl中，使终浓度为10mg/mL,于100加热15分钟，缓慢冷至室温，然后存于-20；Tris饱和酚(pH8.0)；氯仿/异戊醇(24：1)；100%乙醇与70%乙醇，均于-20存放；1.5mLEp管，200L及1mL枪头，灭菌；40L，200L，1mL加样枪；滤纸，1.5mLEp管；冰；.接种一单菌落于3mL含相应抗生素的培养试管中，于37剧烈振荡培养过夜；.将全部培养物分两次倒入1.5mLEp管中,12000g离心1min收集细胞；.将Ep管倒置于一干净滤纸上，将培养基尽可能流尽；.将细菌沉淀重悬于200l冰预冷的溶液I中，剧烈振荡使细菌沉淀分散；.加400L新配制的

12、溶液II,盖紧管口，轻柔的快速颠倒Ep管510次，然后将Ep管于冰上放置5min；.加300L用冰预冷的溶液III,盖紧管口，将Ep管颠倒混合15次左右，然后将Ep管于冰上放置5min；.2,12000g离心5min,将上清转入另一Ep管，加等体积的酚/氯仿，振荡混匀，2,12000g离心5min；.吸出上清,再加等体积的氯仿抽提；.在吸出的上清中加入2倍体积冰冷的乙醇于室温沉淀2min；.2,12000g离心5min,倒出上清，沉淀用70%乙醇洗两次。然后倒置于一滤纸上，让乙醇挥发干净；.高拷贝质粒溶于含5LNA的50TE中；低拷贝数质粒减半。.细菌培养时间不宜过长，一般以1216h为宜，如

13、果培养时间过长，培养物会非常粘稠，这会导致离心沉淀的困难；2一般细菌培养好以后，应该马上提取。如果不能马上提取，于4存放时间不能过长；.加溶液I分散细菌沉淀比较关键，如果分散不好，将直接影响产率；.溶液I加入后，溶液会非常浑浊，加入溶液II颠倒几次后，溶液变清，打开管口，会发现溶液呈鼻涕样，加入溶液III颠倒后，会发现有沉淀物形成，该沉淀物位于溶液上层。如果发现沉淀不能自动聚集，而是呈烂棉花状，且离心后不能沉到管底，则预示着实验的失败；4培养基的成分非常复杂，如果去除得不太干净，则有可能影响到后面的酶切效果；5乙醇必须去除干净，否则会造成电泳点样时上漂；但样品又不能干燥太久，否则有可能使得质粒

14、DNA沉淀难于溶解在TE中。.SDS在低温下会析出结晶，因此配制溶液II时应先于60溶解；.如果一次要提多个样品，可以先一起配制溶液II,而后加入每管。但配制时应略大于所需要的量；EJM109或其它菌种LB液体培养基50mL离心管LB固体培养基LB平板200L枪头，1.5mLEp管，灭菌;42水浴；10L,200L加样枪；培养试管，灭菌；恒温摇床，恒温培养箱；菌液推棒；抗生素储液，本实验室所有的质粒筛选所用的抗生素有两类，氨卞青霉素（Amp）（储液，100mg/mL,溶于无菌水中，工作浓度100g/mL，即每毫升培养基取1L储液）；四环素（Tet）（储液，5mg/mL，先用1/2体积的乙醇溶解

15、，再加入1/2体积的无菌水，工作浓度50g/mL，即每毫升培养基取10L储液。储液全部于-20保存）；冰；SOB培养基(1L);蛋白胨20g,酵母抽提物5g,NaCl0.58g,KCl0.38g,100义镁离子母液(每100mL含MgCl26H2O20.33g,MgSO47H2O24.65g)10mL。用1mol/LNaOH调pH至7.0。SOC培养基：SOB+20mmol葡萄糖（每100mLSOB培养基中加入50%的葡萄糖溶液720L。)0.5mol/LCaCl2：7.35gCaCl22H2O溶于100mLddH2O中。用0.22m的微孔滤膜过滤除菌。1mol/LKCl：7.45gKCl溶于

16、100mLddH2O中，高压灭菌。0.45mol/LMnCl2；8.9gMnCl24H2O溶于100mLddH2O中，高压灭菌。0.5mol/L(K-MES)：9.76g2(-N-吗啡啉)乙磺酸溶于约80mLddH2O中，用KOH调pH为6.2，加水定容至100mL,用0.22m的微孔滤膜过滤除菌。分装后于-20oC保存。二甲基亚砜(DMSO)。TB缓冲液：10mmol/LK-MES(pH6.2)(0.5mol/LK-MES(pH6.2)2mL),45mmol/LMnCl2(0.45mol/LMnCl210mL,15mmol/LCaCl2(0.5mol/LCaCl23mL),250mmol/L

17、KCl(1mol/LKCl25mL)ddH2O60mL。(用上述已经灭菌的母液配制,容量瓶事先也应灭菌。)超净工作台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机。.接种一环E.coliJM109于2mLSOB培养基中，37培养过夜；或者将低温下保存的E.coli解冻后，于LB平板上划线。.取0.5mL过夜培养物或挑一个单菌落于50mLSOB中，于18摇床中培养16-24h至OD600值达到0.6。.取出摇瓶置于冰浴中10min,转入50mL离心管中，4000rpm离心10min,弃上清液，将菌体悬浮于16mL预冷的TB缓冲液中，再置于冰浴中10min后离心收集菌体。.将菌体重新悬浮于4mLTB缓冲液中，加入280pLDMSO使其终浓度为7%,并轻轻摇匀，冰浴至少10min,将感受态细胞分装入EP管中并置于液氮中冷冻5min以上（此时的感受态细胞可于液氮中保存40天以上而不影响转化频率）。.取出EP管让其在冰浴