信号转导的核酸分子基础课件

1、信号转导的核酸分子基础1.碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤鸟嘌呤尿嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶存在于DNA和RNA中仅存在于RNA中仅存在于DNA中一、核酸的组成与结构 (一）核苷酸嘌呤(purine，Pu) 腺嘌呤(adenine, A)鸟嘌呤(guanine, G)嘧啶(pyrimidine，Py)胞嘧啶(cytosine, C)尿嘧啶(uracil, U)胸腺嘧啶(thymine, T)稀有碱基3.核苷嘌呤N-9 或嘧啶N-1与脱氧核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成脱氧核苷(deoxyribonucleoside)。 嘌呤N-9或嘧啶N-1与核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成核苷(ribonucleoside)

2、。NNNN9NH2OOHOHHHHCH2OHH12糖苷键核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。4.核苷酸(ribonucleotide)NNNN9NH2OOHOHHHHCH2H12OPO-HOO糖苷键酯键多磷酸核苷酸cAMP（二）环化核苷酸cGMPWatson-Crick模型Watson，James Dewey（詹姆斯沃森；1928 )弗朗西斯哈里康普顿克里克（Francis Harry Compton Crick 1916.6.82004.7.28）*Chargaff 规则研究背景获得了高质量的DNA

3、分子的X射线衍射照片。提出了DNA分子双螺旋结构(double helix)模型。a.富兰克林 b.DNA的X线衍射图片碱基互补配对三链结构鸟嘌呤之间通过Hoogsteen氢键形成特殊的四链结构(tetraplex)。四链结构原核生物DNA多为环状，以负超螺旋的形式存在，平均每200碱基就有一个超螺旋形成。核小体串珠样的结构核小体链和螺旋管1. 基因组DNA与蛋白质结合成染色体，存于细胞核，（除配子细胞外，体细胞内的基因组是双份的，即双倍体,diploid）有两份同源的基因组。 真核生物DNA特点2.基因转录产物为单顺反子； 即一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。3.存

4、在重复序列，重复次数可达百万次以上； 4. 基因组中不编码的区域多于编码区域； 5.大部分基因含有内含子，基因是不连续的；6.基因组远大于原核生物的基因组，有许多复制起点 （四）RNA的结构（1）tRNA（2）mRNAhnRNA 内含子(intron)mRNA 外显子(exon)（3）rRNA（1）样品DNA或RNA的定量A260 = 1.0 相当于 50g/ml 双链DNA(dsDNA)40g/ml 单链DNA (ssDNA or RNA)20g/ml 寡核苷酸（2）确定样品中核酸的纯度 纯 DNA: A260/A280 = 1.8纯 RNA: A260/A280 = 2.0 核酸提取样品：

5、 A260/A280=1.82.0比值大的纯度不一定高，还可能是提取过程中有酚等其他有机物的干扰。紫外吸收的应用2.核酸的变性、复性和杂交解链温度(melting temperature，Tm)G+C 含量越高，解链温度就越高。退火(annealing)与杂交DNA杂交的退火温度Tm-25（二）核酸的提取、分离和纯化1.DNA的提取分离（1）苯酚法（常用） 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。 可用玻璃慢慢绕成一团，取出。此法的特点：DNA保持天然状态 . (2) CTAB 法 加苯酚有效的去除蛋白质，但是苯酚的氧化物对DNA有破坏作用，用过苯酚之后再用氯仿异戊醇抽提一次以除去

6、残余的苯酚。(3)三氯甲烷法1.三氯甲烷-戊醇除蛋白（中间层）2.水相提取DNA3.三氯甲烷-戊醇再除蛋白4.水相再提取DNA（至无蛋白凝胶）(4)酶法蛋白酶除蛋白核酸酶除RNA提纯DNA（1）Trizol法（异硫氰酸胍苯酚混合液相提取法） 异硫氰酸胍裂解细胞核蛋白体分离RNA释放到水相2.RNA的提取分离（2）硅胶膜特异性吸附离心柱提取法 异硫氰酸胍裂解细胞抑制RNA酶RNA释放硅胶特异性吸附RNA 除去蛋白质和DNA 低盐洗脱RNARNA分布三、核酸含量测定的原理（一）定磷法P：9.4%9.6%（二）定糖法1.核糖2.脱氧核糖（三）紫外吸收法（四）环核苷酸的检测1.竞争性蛋白结合法测cAM

7、P（125IcAMP放免试剂盒 ） 2.放射性免疫法测细胞内cGMP浓度 第六节 信号转导的脂类分子基础 脂肪酸 (fatty acids)脂肪(fat)甘油三酯(动物)油(植物源)类脂(lipids)磷脂固醇及其酯相关化合物脂类三酰甘油 甘油磷脂(phosphoglyceride)胆固醇酯 FA胆固醇 FAFAFA 甘油 FAFAPiX 甘油 X=胆碱、水、乙醇胺、丝氨酸、甘油、肌醇、磷脂酰甘油等。一、脂类基本构成： 分类含量 分布 生理功能脂肪三酰甘油 95脂肪组织、血浆1. 储脂供能2. 提供必需脂酸3. 促脂溶性维生素吸收4. 热垫作用5. 保护垫作用6. 构成血浆脂蛋白类脂糖酯、胆固

8、醇及其酯、磷脂5生物膜、神经、血浆1. 维持生物膜的结构和功能2. 胆固醇可转变成类固醇激素、维生素、胆汁酸等3. 构成血浆脂蛋白脂类的分类、含量、分布及生理功能脂类的生理功能血浆脂蛋白 组成：蛋白质、甘油三酯、磷脂、胆固醇及其酯内核： 甘油三酯 胆固醇酯中性脂类 CM VLDL LDL HDL密度0.950.951.0061.0061.0631.0631.210组成脂类含TG最多， 8090%含TG 5070%含胆固醇及其酯最多，4050%含脂类50%蛋白质最少, 1%510%2025%最多，约50%载脂蛋白组成apoB48、E A、A A、C C、CapoB100、C、C C、 EapoB

9、100apo A、 A磷脂是指含磷酸的脂类二、磷脂甘油磷脂：由甘油构成的磷酯（体内含量最多）鞘磷脂：由鞘氨醇构成的磷脂X指与磷酸羟基相连的取代基，包括胆碱、水、乙醇胺、丝氨酸、甘油、肌醇、磷脂酰甘油等。FAFAPiX 甘油FA PiX 鞘氨醇相同的组成成份(分子数)不同或不尽相同的组成成份磷酸脂酸醇类其他成分甘油磷脂12甘油胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇等鞘磷脂11鞘氨醇胆碱甘油磷脂与鞘磷脂的分子组成（一）甘油磷脂组成：甘油、脂酸、磷脂、含氮化合物结构： 功能：含一个极性头、两条疏水尾，构成生物膜的磷脂双分子层。常为花生四烯酸 X = 胆碱、水、乙醇胺、 丝氨酸、甘油、肌醇、磷脂酰甘油等 (cep

10、halin) (lecithin) 磷脂酰肌醇 (phosphatidyl inositol) 磷脂酰丝氨酸 (phosphatidyl serine) 心磷脂 (cardiolipin)原料：脂酸、甘油 胆碱、丝氨酸、肌醇、磷酸盐丝氨酸 乙醇胺 胆碱 CO2 3 SAM（S-腺苷甲硫氨酸）部位： 内质网（二）甘油磷脂的合成1.甘油二酯合成途径（卵磷脂、脑磷脂）2.CDP-甘油二酯合成途径（心磷脂、磷脂酰肌醇）PLA1 PLA2PLCPLDPLB2PLB1磷脂酶 (phospholipase , PLA)（三）甘油磷脂的降解（四）鞘磷脂三、脂类第二信使及分析1.IP3的分离测定 取细胞溶解液水相2ml装入Dowex l8 Formate型微型沉析柱(Sigma产品)，分别用15ml水、10ml四硼酸钠/甲酸钠(560mol/L)、6ml甲酸/甲酸铵(0.10.2mol/L)、10ml甲酸/甲酸铵(0.10.4mol/L)、7ml甲酸/甲酸铵(0.11.0mol/L)分别洗脱游离肌醇(FMI)、糖磷脂酰肌醇(GPI)、1-磷酸肌醇(IP)、2-磷酸肌醇(IP2)、3-磷酸肌醇(IP3），分步收集各段洗脱液，每管1ml，液闪测定各管放射活性，绘制洗脱曲线并测定每段的总放射活性。2.DAG测定 （1） 向培养的M中加入3H-甘油 （2） 置5% CO2 95%空气孵箱中37孵育