磷酸化 2011 硕士课件

1、蛋白质磷酸化与非磷酸化 非活性蛋白与活性蛋白的构象之间的转换是通过可逆共价修饰调节蛋白质的方式，蛋白激酶则是这一过程催化磷酸化的重要蛋白，而磷酸酯酶是去磷酸化的重要蛋白. 已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸.根据是否有调节物来分又可分成两大类： 信使依赖性蛋白质激酶（messenger-dependent protein kinase），包括胞内第二信使或调节因子依赖性蛋白激酶及激素（生长因子）依

2、赖性激酶两个亚类；非信使依赖型蛋白激酶。1、Ser/Thr蛋白激酶 蛋白磷酸化是蛋白激酶将磷酸基因转移到特定底物蛋白上的共价修饰过程，调控蛋白质的酶学活性或生物学功能。分为: cAMP依赖的PK Ca2+/磷脂依赖的PK Ca2+/ （CaM）钙调蛋白依赖的PK cGMP依赖的PK 近年发现新成员DNA依赖的PKcAMP依赖的蛋白激酶（ cAMP dependent protein kinase.APK） cAMP-依赖蛋白激酶是一种四聚蛋白酶，含有两个调控亚基和两个催化亚基。当cAMP-依赖蛋白激酶的调控亚基结合时，激酶解离成两个具有催化活性的蛋白激酶（由催化亚基形成）和一个二聚的调控亚基。

3、 cAMP-依赖蛋白激酶被活化后，它解离出来的活性蛋白酶能够催化ATP分子与目标代谢酶分子的磷酸化反应。一般是代谢酶的Ser或Thr残基的羟基被ATP磷酸化，其结果是代谢酶被抑制或激活。磷酸化代谢酶可在蛋白磷酸酶作用下去磷酸化而激活或失活。cAMP即是通过上述机制实现对代谢酶活性的调控。结构与功能2个调节亚基（R）+2个催化亚基（C）APK全酶复合体（R2C2）（无cAMP时，无活性）cAMP与特异R亚基结合构象变化 R亚基二聚体+2个有活性C亚基,各种哺乳动物细胞于不同水平表达3种C亚基亚型(CCC)和4种R亚基亚型(R R R R ) 结合成全酶APK 型和 型.不同R亚基亚型主要区别:

4、RMg2+/ATP高亲和位点 R自身磷酸化 细胞分布与移位R亚型主要位于胞浆、神经组织中，R亚型分布于浆膜、细胞骨架成分、树突、分泌颗粒和核膜，是R 作用于特定的锚定蛋白所致底物多巴胺和cAMP调节的磷蛋白（dopamine and adenosine-3, 5-monophosphate regulated phosphoprotein DARPP-32）是PKA的有效底物，存在于具有D1多巴胺受体的神经细胞胞浆中。2、DAG作用：激活蛋白激酶C,将存在于靶蛋白质中得丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化， 改变靶蛋白质的活性。如:糖原合成酶磷酸化后，停止合成糖原。3、DAG与IP3的协调作用IP3 细胞

5、质中Ca2 + 糖原合成酶活性蛋白激酶C 使IP3 诱导增高糖原磷酸化酶活性的过程终止。 4、DAG的激活机理 DAG 增加蛋白激酶C对Ca2 + +的亲合性在Ca2 +生理水平上被活化。蛋白激酶C为 77kd , 催化区抑制调节区,当DAG结合到蛋白激酶C上，解除酶的调节区的抑制作用，使酶发挥催化活性。III、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶 CaM（钙调蛋白）作为细胞内Ca2+受体，由148个氨基酸碱基组成的可溶性球蛋白 结构特点：（1 ）30%的酸性氨基酸，过量羧基提供了Ca2+可逆性结合的基团。（2）不含能使肽链定型的成分，即易氧化的半胱氨酸和羟脯氨酸，因而CaM具有高度灵活的，可与机

6、体蛋白相互作用的三级结构。概念：CaM对第二信使Ca2+起反应所激活的蛋白激酶成为多功能的Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶（Ca2+Calmodumin dependent protein kinase，CaM-PK）1978年schulman 首次在突触体膜上发现了II型CaM-PK（CaM-K ) CaM的一级结构在进化上有很强的保守性a、 同真核生物CaM呈现免疫交叉反应b、 CaM结构若突变， 容易致死。保守性 CaM二级结构是两个类似的球状叶片通过一段肽链的 连接 而组成整个的分子a、 每一个球叶中含两个Ca2+结合位点，每个结合位点-12个AA残基，腔式结构，半径0.1nm, 两旁

7、 连接两条相互垂直的-螺旋-有8个AA残基,组成EF手图像，两个EF 手单位间相距1.1nm b、 在一个球叶中，两个Ca2+结合位点对Ca2+有很高亲和性,在另一个球叶中的位点则亲和性较低 CaM的生理功能a、 调节环式核苷酸代谢b、 调节Ca2+代谢c、 细胞运动，收缩体系与细胞形状d、 糖质的代谢e、 细胞分裂与核酸代谢f、 神经递质的合成与释放g、 前列腺素与磷脂代谢h、 调节植物细胞代谢i、 CaM是细胞代谢调控的综合剂 CaM结构的 EF手图象许多钙结合蛋白串的钙结合位点是由一个螺旋区-泡区-螺旋区的结构单位组成IV、cGMP依赖的蛋白激酶 (cGMP dependent prot

8、ein kinase,GPK) Ashman 等1963年从肾脏首次发现cGMPV、DNA依赖的蛋白激酶( DNA dependent protein kinase,DNA-PK) 是一类存在于细胞核内，能被DNA激活的特异的Ser/Thr PK 引起多种核结合蛋白磷酸化。第二类、 酪氨酸蛋白激酶 对于许多生长因子受体的研究表明，跨膜的酪氨酸蛋白激酶在信息传递过程中起着重要作用。表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、神经生长因子（NGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体都拥有定位于胞内的酪氨酸激酶功能区域和膜外区

9、。 具有受体功能的酪氨酸 蛋白激酶 (receptor protein tyrosine kinase, RPTK)。包括三个结构域：胞外的配体结合区，细胞内部具有酪氨酸蛋白激酶活性的区域和连接这两个区域的跨膜结构。胞外配体结合区：RPTK的N端大约500-850个氨基酸组成亲水性胞外配体结合区域，氨基酸序列变化较大，是不同RPTK与相应配体特异性结合的结构基础。跨膜结构区：是连接受体细胞内、外两部分，镶嵌在细胞膜中的结构，在靠近膜内侧C端常常是由碱性氨基酸形成簇状结构。胞内活性区：保守性较高，由三个不同的部分组成。与跨膜区相连的近膜区包括41-50个氨基酸，可能是RPTK活性的功能的调节部位

10、。第二部分为活性位点所在的催化区，其氨基酸组成具有很高的保守性。该区含有ATP结合位点和底物结合位点，可能是不同类型RPTK底物特异性的决定区域。第三部分是多变的C末端，包括70-200个氨基酸，主要是由小分子量氨基酸组成的亲水性结构，具有高度的可塑性。（二）蛋白激酶抑制剂1、Ser/Thr蛋白激酶抑制剂（1）与ATP竞争的抑制剂 H系列化合物W-7N-(6-aminohosyl)-5-chloro-1-nahpalenesulfonamide是CaM拮抗剂，以Ca2+依赖方式与CaM结合选择性抑制Ca2+/ CaM依赖性激酶，也能与ATP竞争抑制蛋白激酶，但作用较弱。H-89 选择性的PKA

11、抑制剂ML-9 是MLCK（肌球蛋白轻链激酶）的特异抑制剂H-7 是蛋白激酶C（PKC）较为有效的抑制剂（2）含吲哚咔唑生色基团的抑制剂Staurosporine 来源于放线菌属 Ki最低，是PKC、APK等抑制剂UCN-01 较特异抑制PKC，还有抗肿瘤作用。2、与蛋白激酶辅助因子竞争的抑制剂（1）PCK抑制剂 Calphostins：是作用于PCK的的DAG结合位点的抑制剂 鞘氨醇 能与Cu2， PS和DAG竞争抑制PCK，也是CaM的拮抗剂（2）CaM依赖性蛋白磷酸抑制剂 甲状腺素：能与CaM竞争MCLK结合而抑制其活性 异喹啉衍生物KN-62: CaM K II 抑制剂（较为特异的）（3）与蛋白/肽底物竞争抑制剂 Walsh：是较为特异的APK抑制剂。同肽底物竞争（三）蛋白磷酸酯酶（protein phosphatase 。） 70年代末PTPase活性首次被发现，已知对Ser/Thr激酶的磷酸酯酶有PP1,PP2A,PP2B,PP2C,PPx等分布涉及各组织以至细胞器，定位各有有侧重，均有亚型 PP1(位于胞浆为为PP11 糖原分子为PP1G,位于肌丝为PP1M,核为PP1N) PP2A主要存在胞浆，少数在线粒体和核 PP2B与膜连接有关（调节亚单位 氨基末端甘氨酸残基豆蔻化） PP2C只要存在于胞浆