生物化学 常用技术课件

1、第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application技术对理论的推进:X射线衍射技术对DNA双螺旋结构发现的作用.1952年,富兰克林用X线拍下了DNA分子结构的B型照片,经证明: 1.只有螺旋各级才能出现交叉形的反射线条,2.螺旋每隔34A重复一次,表示了螺旋旋转一周的距离 3.双链间的碱基的连接是靠很多不规则的氢键完成的 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology核酸分子杂交 (nucle

2、ic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理复性RNADNA探针标记物标记探针靶核酸杂交体二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析 (Western blott

3、ing) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 其他斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)三种印迹技术的比较分子杂交实验目 录DNA点阵目 录第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 55一、基本工作原理目 录Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循环后，模板DNA的含量

4、可以扩大100万倍以上。目 录模板DNA 特异性引物耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ 二、PCR体系基本组成成分三、PCR的基本反应步骤变性95C延伸72C退火Tm-5C（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析四、PCR的主要用途三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术第 三 节 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一

5、性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。Sequence MasterFred Sanger, 1958Was originally a protein chemistMade his first mark in sequencing proteinsMade his second mark in sequencing RNA1980 dideoxy sequencing二、DNA链末端合成终止法1958年

6、他因在蛋白质结构方面的工作，主要是胰岛素，第一次获诺贝尔奖。1980年发明了DNA测序方法，第二次获诺贝尔奖。全世界只有四人两次获诺贝尔奖。Sanger Method Sequencing GelgbaA deoxyNTP12345gbaA di-deoxyNTP12345目 录三、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 S

7、CHEMATIC OF A TRADITIONAL SEQUENCING GELAUTORADIOGRAMA CG T SEQUENCE IS READ FROM BOTTOM TO GIVE5 ACGCTAGGGCTCAA 3SCHEMATIC OF HOW A DYE-DEOXY GEL MIGHT LOOK IF PRODUCTS RUN ON DIFFERENT TRACKSA CG T COMBINED REACTIONS COMBINED REACTIONS FLUORESCENCE DETECTORACTIVATIONLASERDNA自动测序结果举例目 录1970年测12000个

8、碱基需一年获更多的时间。1987年测序12000个碱基仅需20分钟。今天协作组每秒产出“草图”中的12000个碱基。1990年，人类基因组计划刚开始时，每个碱基测序至少要花10美元。随着测序过程的改进，自动快速的读取序列，已将测序成本降至每碱基10美分左右。意义：DNA测序法的建立，表明了人类也可以像细胞一样去读取细胞的信息，也从此打开了通往确定全部遗传学指令的大门，为解析任何生物的全部遗传密码也就是基因组序列开辟了道路。 基 因 文 库Gene Library第 四 节基因组DNA文库 (genomic DNA library)cDNA文库 (cDNA library) 基因文库 (gene

9、 library)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。目 录第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第 五 节克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆(functional cloning)（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene

10、 approaches )定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。（一）功能性克隆应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库； 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。 功能互补试验 (functional complementation assay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 （二）定位克隆定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析染色体异常(缺失、易位等)分

11、析、基因文库的筛选与基因克隆（三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。第 六 节遗传修饰动物模型的建立及应用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 转

12、基因被导入的目的基因转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物一、转基因技术目 录核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。二、核转移技术基因剔除技术也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用建立动物模型 单基因决定疾病模型 基因剔除获得性突变(gain-of-function mutation) 多基因决定疾病模型第 七 节 生 物 芯 片 技 术Biological Chip Technolo

13、gyDNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。一、基因芯片基因芯片(gene chip)目 录 由于DNA微阵列技术，基因表达的解析已成为可能，个体基因差异也正在被发现，并产生了一个新的领域药物基因组学，药物开发的模式发生了根本性的改变。 过去100年以来，人类研制的医药品大约有450种类型（利尿药、受体阻断药、Ca受体阻断药等分别作为一个类型）。而由于基因组科学的诞生，预测今后10年将有4000种的药物类型被开发。这其中有改善以前的药品的缺点（如吸收性、选择性、毒性等）而得到

14、的药物和过去由于各种理由而退出使用的药品的再生。人类基因组的30亿个碱基对包含的3-4万个基因中，估计有5000个以上的药物标靶，而现在的药物标靶只有不到500个。标靶：在膜蛋白分子中，像离子通道和G蛋白共轭型受体作为已知药物的标靶已寻找到。如果从新的G蛋白共轭型受体中可以发现其对应配基，那么其中的兴奋剂以及拮抗剂成为新药的可能性极大。个体基因差异影响药效 即使应用同样的药品，效果显著的患者与无效的患者同时存在，出现副作用与不出现副作用的情况也同样存在，即使被认为效果比较好的降压药也只有60%的有效率。而这里面很大的差别主要是由于基因多态性而引起的，所以对基因多态性进行诊断，从而提高药物应用效率，减少副作用。确定基因多态性的研究，主要体现在对单核苷酸多态性的检测。基因组解析即可完成这一任务。是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)第 八 节蛋白质相互作用研究技术 Research Technology of Interaction of Protein蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几