实时荧光定量PCR技术原理及其仪器分析课件

1、 实时荧光定量PCR技术原理及其仪器分析PCR1983年 Cetus公司的Kary Mullis于12月16日第一次成功实验发明了PCR，并于1993年获得诺贝尔化学奖1995年 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术九十年代中期 PCR临床应用在国内全面展开1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测PCR之父Mullis 循环次数 DNA的链数 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿 PCR循环次数与DNA产量关系PCR特点：高效扩增、忠实复制实时荧光定量

2、PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon SYBR Green SYBR Green 法工作机理 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PC

3、R反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNA 使用方便 -不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜优 点 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高缺 点每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补重复性比较好优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针缺 点分子信标法标记荧光的发夹探针 环与目标序列

4、互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针应用范围 起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优 点 只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高缺 点荧光PRC的系统结构热模块系统光学系统荧光检测系统分析系统光学系统荧光检测系统CCDPMT，光电二极管，扫描机制PMT，光电二极管，旋转机制使用方法使用注意事项1. 按照正确的开关机顺序操作2. 应该定期备份的实验数据3. 良好的实验室环境常见问题判断样本加热块是否被污染 不正常的高信号 污染 某个孔的信号明显高出其他孔 污染清除样本加热块污染 乙醇去

5、离子水蒸发荧光定量PCR的定量分析是根据标准曲线的每个标本的Ct值进行的。在获得各个标本的PCR扩增曲线后，计算机软件自动确定用于定量分析的Ct值。Q-PCR分析采用已知物的标准曲线来定量未知目的物。 标准曲线定量拷贝数=DNA摩尔质量DNA质量（g）x 6.02 x 1023_相对定量分析用目的基因与对照基因进行样品间的比较。通过从目的基因的Ct减去对照基因Ct获得相对于对照基因的定量，循环数差别是基数2的指数，表示这两个基因的模板倍数差别。PCR效率（E）=10 -1(-1/S)标准曲线制作已知基因DNA质粒载体 RNA样品PCRRNA样品浓度克隆DNAase光密度仪纵坐标：Ct 横坐标：lgRNA模板数RNA拷贝数荧光PCR的局限性在标准曲线定量中，由于无一统一标准，各实验室所用的生成标准曲线的样品不相同，使实验结果缺乏可比性。在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物是实验结果可靠与否的关键。与传统PCR相比的不足之处（1）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此不能监测扩增产物的大小；（2）荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制