基因表达分析技术课件

1、 医学分子遗传学 第四章分子遗传技术方法 基因表达分析技术METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSIONSpeaker：2022/9/301genemRNAProtein polypeptide chainGene Expression2022/9/302一、实时荧光定量PCR （real time quantitative PCR，RT-qPCR）2022/9/303实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR，RT-qPCR)是荧光化学物质与PCR产物相结合，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进

2、程，对起始模板进行定量分析的方法。荧光定量实时PCR与普通PCR的比较在线实时监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控，精确定量 结果分析更快捷方便，无需电泳 非特异性荧光染料标记：SYBR Green I 特异性荧光标记：TaqMan优点与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物荧光信号强与其它探针相比设计简单可用于多通道检测 可用于SNP的检测缺点由于它和模板的结合是非特异性的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异

3、性扩增产物结合，不能真实反映目 的基因的扩增情况比DNA结合染料价格高2022/9/307Ct（ threshold value ）值是指荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，此时荧光信号明显高于背景荧光信号。2022/9/308相对定量（Relative quantification）是计算要处理样本相对于正常（内参基因）样本的基因表达量变化，属于倍数关系式，扩增效率达到100%时用2 -CT 法来分析处理实验数据。实验过程中还要引入一个或多个内参基因进行校正和标准化。内参基因（Reference gene）是指在不同类型细胞、不同实验处理条件下恒定表达的一类管家基因，常用的内参基因有b-a

4、ctin、GAPDH、18sRNA、efla等。2022/9/3010相对定量分析方法1 2 -Ct前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏差在5以内。1计算Ct：Ct=Ct 靶基因Ct GAPDH，分别计算实验组和对照组的Ct。2计算Ct：Ct=Ct实验组Ct对照组。3计算相对表达量的差值。2 Ct 靶基因AGAPDHCt对照组实验组相对定量分析方法2：双标准曲线法前提：目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度2、反转录2022/9/3014（1）、NCBI 官网 gene bank 查找xx基因cD

5、NA序列，根据cDNA序列设计RT-qPCR引物，产物长度80-150bp最佳。引物由primer 5软件设计，正反引物的Tm 值相差小于2，GC%比小于3。（2）、设计好的引物再通过NCBI blast 引物比对官网进行初步筛选，并将设计好的引物交由相关基因公司（如华大基因）合成。（3）、新合成的引物以cDNA 为模板，添加gene star PCR mix 进行预实验，设计多个实验重复，ABI梯度PCR仪上进行梯度PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，marker 比对结果判定产物大小及引物退火温度的最佳条件。（4）、将ABI 梯度PCR 仪在最佳退火条件下扩增的PCR产物交由相关基因公司（

6、如华大基因）进行普通测序，用于判断测序结果与目标片段是否吻合，引物位置与初始引物设计位置是否相同。3、设计引物2022/9/30155、确定目的基因和内参基因的扩增效率 及定量PCR数据处理方法根据绝对定量PCR原理，对cDNA进行5个数量级的10倍梯度稀释，利用各个浓度的cDNA进行绝对定量以获得相关基因的扩增效率。2022/9/3017每个样本基因的PCR反应设置3个平行重复以保证实验结果的准确性，数据处理采用均值计算。反应体系体积SYBR Green I Master Mix10ulForward Primer(10umol/L)1ulReverse Primer(10umol/L)1ulcDNA 模板1ulRnase ddH2O7ul总体积20ul6、实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR，RT-qPCR)反应体系2022/9/3018PCR均采用10 min预变性，彻底打开聚合酶活性。为了提高PCR扩增效率，采用变性及退火进行扩增40个循环。扩增结束后在相应的温度和时间中进行变性和退火后开始“溶解曲线程序”。通过溶解曲线判断产物的单一性及引