基因表达分析技术课件

1、 基因表达分析技术METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSION基因表达分析技术基因mRNA蛋白质多肽链基因表达基因mRNA蛋白质多肽链基因表达一、通过检测mRNA揭示基因转录水平的表达特征根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为:封闭性系统研究方法: 例如DNA微阵列、Northern印迹、实时RT-PCR等方法。只能研究已知的基因。开放性系统研究方法: 如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。一、通过检测mRNA根据分析方法的原理和功能特性，

2、可将基因表（一）基于杂交原理检测mRNA的表达水平1Northern 印迹（Northern blot）是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种RNA分析技术指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。（一）基于杂交原理检测mRNA的表达水平1Northern三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较RNA琼脂糖凝胶电泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18SRNA琼脂糖凝胶电泳3kbNtNorthern blot h分子杂交实验分子杂交实验放射自显影照片目 录放射自显影

3、照片目 录2核糖核酸酶保护实验（ribonuclease protection assay，RPA）是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法 基本原理 是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目的RNA结合，形成双链RNA，免受RNA酶的消化；而未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸。2核糖核酸酶保护实验RPA基本程序：待测RNA的分离体外转录标记RNA探针待测RNA与探针RNA进行液相杂交 RNA酶消化不同大小杂交片段凝胶电泳分离RPA基本程序：待测RNA的分离核糖核酸酶保护实验原理示意图32P标记的探针：杂交双链

4、进行变性PAGE， 用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；生物素标记的探针：杂交双链经过变性PAGE后，电转移至尼龙膜，用链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。核糖核酸酶保护实验原理示意图32P标记的探针：杂交双链进行变RPA比Northern Blot的优势：1.过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全 2.RPA比Northern Blot灵敏15150倍，适合检测各种表达水平之基因 3.RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达 4.一次RPA就能完成10 多次North

5、ern Blot的工作，加快研究速度RPA比Northern Blot的优势：可细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位标记探针特异性地与目标靶mRNA序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。可作为定量分析的补充。3原位杂交（in situ hybridization，ISH）可细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位3原位杂交（i原位杂交技术主要步骤：材料处理及细胞样品的固定；样品的制备和预处理；探针的制备和预杂交；探针及样品的变性；杂交温育；检测杂交信号，进行结果分析。原位杂交技术主要步骤：材料处理及细胞样品的固定；（二）RT-PCR常用的mRNA检测方法1反转录

6、PCR可用于mRNA的半定量分析 反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 它以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。反转录实时定量PCR （二）RT-PCR常用的mRNA检测方法1反转录PCR逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增PCR技术原理PCR技术原理5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template

7、 DNA55 555 5 55一、基本工作原理目 录5Primer 15Primer 2Cycle 2CycCycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目 录Cycle 355 555 5 555 5模板DNA 特异性引物耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR体系基本组成成分模板DNAPCR体系基本组成成分PCR的基本反应步骤变性95C延伸72C退火Tm-5CPCR的基本反应步骤变性延伸退火实验仪器电泳仪实验仪器电泳仪琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽PCR仪PCR仪PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点

8、PCR反应PCR反应条件实验结果PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）实验结果PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（凝胶成像系统凝胶成像系统Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle

9、= 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconTarget AmplificationNo. ofNo.常规PCR方法的局限性分析：无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒无法对扩增反应实时检测常规PCR方法的局限性分析：无法对起始模板准确定量,只能对终2、实时荧光定量PCR （real-time PCR）2、实时荧光定量PCR （real-time PC非特异性的嵌入荧光染料 （Non-specific DNA binding dyes）SYBR Green ISYBR GoldEthidium Bromide 非特

10、异性的嵌入荧光染料 （Non-specific DNAExtension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatDNA binding dyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllllExtension53535353Exten实时PCR技术原理目 录实时PCR技术原理目 录非特异性的嵌入荧光染料评价优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反

11、映目 的基因的扩增情况。非特异性的嵌入荧光染料评价优点：与特异性的荧光探针相比价格便TaqMan探针 评价优点：荧光信号强 与其它探针相比设计简单 可用于多通道检测 可用于SNP的检测缺点：比DNA结合染料价格高TaqMan探针 评价优点：荧光信号强Ct value and Real-Time Quantitative PCR TheoryCt值（Threshold Cycle） PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数。Ct value and Real-Time Quantit 模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模

12、板起始浓度的关系 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达 模板起始浓度越高，Ct值越小Ct值与模板起始浓度的关系 如绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度 利用已知起始拷基因表达分析技术 3、原位PCR技术基因表达分析技术原位 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利

13、用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列原位 原位聚合酶链式反应（In Still PC16块载玻片及24个0.2ml管的样品block 16块载玻片及24个0.2ml管的样品block 基因表达分析技术操作步骤1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）2. PCR扩增细胞内目的片段3. 原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRN

14、A表达操作步骤A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。4、基因芯片分析基因表达谱（高通量地分析基因表达）基因芯片(gene chip)DNA芯片(DNA chip) 4、基因芯片分析基因表达谱基目 录目 录二、通过蛋白质检测揭示基因 翻译水平的表达特征 Western印迹（Western blot）是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。当在

15、蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。（一）采用特异抗体经Western印迹可直接 测定基因编码多肽二、通过蛋白质检测揭示基因 Western印迹蛋白质样品的制备SDS分离蛋白质转膜特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig）最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息Western blot基本程序Western blot基本程序基因表达分析技术基因表达分析技术基因表达分析技术West

16、Blot West Blot 受检标本+固相载体表面的抗原或抗体起反应结合特异抗体（一抗）酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。（二）酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）受检标本+固相载体表面的抗原或抗体起反应结合特异抗体（一特点：1、具有特异性；2、灵敏度很高；3、稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查， 尤 其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；4、既可以做定性试验也可以做定量分析。 酶联免疫吸附分析特点： 酶联免疫吸附分析 免疫组织化学（immun

17、ohistochemistry）是利用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。（三）免疫组化实验对组织/细胞 表达的蛋白质进行原位检测 免疫组织化学（immunohistochem基因表达分析技术人皮肤角化细胞免疫荧光染色人皮肤角化细胞免疫荧光染色（immunofluorescence），可应用荧光（倒置）显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal microscopy）对靶分子进行定性、定量和定位分析，激光共聚焦显微镜还可进行断层成像，是在蛋白质水平

18、分析基因表达的直观方法。其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键因素。运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间相互作用信息的有效方法。免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。（immunofluorescence），可应用荧光（倒置） 流式细胞术（flow cytometry）在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定蛋

19、白质的水平对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。（四）流式细胞术用于分析细胞 特异表达的蛋白质 流式细胞术（flow cytometry）流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞。广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同时对多个基因产物进行标记和监测，是对细胞进行快速分析、分选、特征鉴定的一种有效方法。流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞。是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可

20、用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质/DNA-蛋白质/RNA-蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子-蛋白质等的相互作用（五）蛋白质芯片分析蛋白质表达谱（高通量地分析基因表达）蛋白质芯片(protein chip)是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上蛋白质检测芯片包括:抗体芯片抗原芯片配体芯片等蛋白质检测芯片包括: 目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 简称2-D电泳）结合质谱技术。 原理: 根据蛋白质分子的两个属性等电点和分子质量将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，即可对不同

21、样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用质谱（mass spectrum）技术进行定性分析，对差异表达的蛋白质进行鉴定。 可同时分离数成百上千的蛋白质。（六）双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达谱的分析和鉴定 目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向电泳（tw 双 向 电 泳 技 术Two-dimemsional gel electrophoresis, 2DE技术构成：第一相：IEF 采用丙烯酰胺与不同PH的两性 电介质形成的固定的PH梯度 IEF- PAGE第二相：分子筛凝胶 SDS- PAGE特点：1. 一次分离细胞中几乎所有的蛋白质

22、（以spot形式出现）2. 高灵敏度和高分辨率 用银染条件下，可达10-1510-18 mol水平3. 便于计算机分析处理 电泳分离图谱经扫描输入计算机，可以进行蛋白质定位, 等电点,分子量定量不同条件下的图谱进行比较,建立蛋白质组数据库 双 向 电 基因表达分析技术基因表达分析技术基因表达分析技术基因表达分析技术质 谱 技 术 质谱仪 进样系统 离子源 质量分析器 离子探测器系统质 谱 技 术 质谱仪在蛋白质组学研究中常用的质谱仪电喷雾离子化质谱仪（ESI-MS）基质辅助的激光解吸离子化飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）四极杆-TOF质谱仪（Q-TOF）在蛋白质组学研究中常用的质谱仪

23、电喷雾离子化质谱仪（ESI-M质谱技术在蛋白质组研究中的作用1. 肽质谱和肽的序列分析2. 翻译后修筛的蛋白质鉴定 N端封闭，磷酸化，糖基化3. 其它：蛋白质二硫键的定量和定位蛋白质蛋白质相互作用的分析蛋白质其它分子相互作用的分析蛋白质二级结构的分析比较不同条件（正常细胞与异常细胞，不同发育阶段从中获得单个有价值的蛋白质结构与功能质谱技术在蛋白质组研究中的作用1. 肽质谱和肽的序列分析标签融合蛋白沉淀实验流程示意图标签融合蛋白沉淀实验流程示意图 白质相互作用研究领域里得到极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST 与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面： 一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存