临床微生物学检验和抗菌药物敏感性试验进展

1、关于临床微生物学检验与抗菌药物敏感性试验进展第1页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四第一节 概述一、现代感染性疾病的特点感染性疾病（infectious diseases）是指各种生物性病原(病原微生物、寄生虫)寄生人体所引起的传染性感染疾病和非传染性感染疾病。 （一）疾病谱发生变迁，发现了很多引起传染病的新病原 体，如嗜肺军团菌、汉坦病毒、埃博拉病毒、尼巴病毒、朊病毒、SARS冠状病毒等。而且已经绝迹的旧传染病又死灰复燃，如梅毒、结核病、霍乱等。 （二）多重耐药株的出现，导致抗感染治疗的困难（三）器官移植、抗肿瘤化疗和放疗的开展，减弱了机体的 免疫防御功能，造成医院感染

2、及条件性致病菌感染的增加 上一页下一页返回第2页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四二、感染性疾病的实验诊断方法（一）一般实验室检查 1.血常规检查 2.C反应蛋白(CRP) 3.降钙素原(PCT), PCT是严重细菌性炎症和真菌感染的特异性指标，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标。如果给予足够的刺激，免疫抑制的患者将产生PCT，PCT不仅是用于鉴别诊断的急性指标，而且是监控炎症活动的参数。 （二）病原学实验诊断 感染性疾病的病原体的实验诊断方法包括病原体的分离培养、病原体特异性抗原抗体的检测、病原体核酸检测等多种方法。上一页下一页返回第3页，共41页，20

3、22年，5月20日，17点11分，星期四第二节细菌感染的实验诊断一、标本的采集与培养方法（一）标本采集原则： 1.采集标本时应无菌操作，尽量避免污染。盛放标本的容 器和培养基应预先进行无菌处理并贴好标签。 2.应选择感染部位或病变明显的部位采集标本，避免周围 组织、器官或分泌物中的杂菌污染。 3.根据病原体在感染性疾病的不同时期的体内分布和排出 部位选择在最佳时间采集适宜标本。 4.对于怀疑细菌感染的标本，尽量在抗生素使用前采集。 5.标本采集后应及时送检。大多数细菌标本应冷藏送检， 但是某些细菌，如脑膜炎奈瑟菌对低温和干燥极其敏感 ，应注意保温，尽量床旁接种，并预温相应的培养基。上一页下一页

4、返回第4页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四（二）常用标本的采集及培养方法1.血液 血培养是用于检测细菌、真菌等患者血液中的微生 物的方法。 1). 采血时机：通常细菌从感染部位入血1小时后，引起机体发热，因此，如果能够准确预测病人发热时间时，在发热前半小时至一小时采血最好。当无法准确预测病人发热时间时，可在发热时采血。细菌性心内膜炎患者可随时采血。2). 采血量：成人每次每瓶最好采血8-10ml，小儿每次每瓶可采血1-5ml。3). 采血次数：成人每天采血2-3次，通常间隔半小时或1小时，在患者不同部位采血。4). 培养方法：通常每次将血液分别加入需氧和厌氧两种培养瓶中

5、35C同时进行培养。每天观察结果。3天后如果无菌生长则报告“培养48小时无菌生长”； 7天后如果无菌生长则报告“培养7天无菌生长”。上一页下一页返回第5页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四2.尿液 正常人体内，膀胱中的尿液是无菌的，尿液经尿道排出时，受尿道细菌的污染而会混有细菌，但取中段尿时，细菌数不会超过103CFU/ml。 1).标本采集：清洁外阴部位，用无菌容器留取中段尿10ml。2).培养方法：尿液一定要做定量培养，通常取1ul或10ul尿 液进行培养，报告时要报告1ml尿液中的菌落数，当取 1ul尿液培养后发现无菌生长，要报告“小于1000 CFU/ml”。3)

6、.结果解释：通常引起泌尿系统感染的细菌有大肠埃希菌、 肺炎克雷伯氏菌等肠杆菌科细菌及肠球菌等革兰氏阳性球 菌。90%以上的泌尿系统感染为单一细菌感染，只有很少 量患者为两种混合细菌感染，当培养出三种以上的细菌 时，可视为标本污染。当培养出大于105 CFU/ml的细菌时， 通常认为可能是尿路感染或肾盂肾炎，当培养出104-105 CFU/ml的细菌时，诊断不确定，当培养出小于103 CFU/ml的 细菌时，通常认为是标本污染。上一页下一页返回第6页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四3.脑脊液 中枢神经系统的感染有很多原因。化脓性脑炎主 要是由细菌、真菌等引起，偶尔也由寄生

7、虫引起。1).标本采集：按先后顺序取3管脑脊液，每管2-5ml。1号试 管：细菌检查；2号试管：生化学或血清学检查；3号试 管；细胞计数等常规检查。2).革兰氏染色检查有助于迅速查出肺炎链球菌或流感嗜血 杆菌等细菌性感染。3).培养方法：将脑脊液1500转离心15分钟，取沉渣进行培 养，5%CO2环境、35C培养3天。上一页下一页返回第7页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四4.痰 正常人体的下呼吸道是无菌的，留取痰标本时由于经 常混入上呼吸道的分泌物，通常痰培养时总是可以见到上呼吸道的正常菌群。因此判断下呼吸道中是否有致病菌，必须了解上呼吸道的正常菌群。留取的痰标本的质量

8、也直接影响培养的结果。根据痰涂片革兰氏染色的结果可以判断痰标本的质量。培养方法：将痰液进行洗净、均质化处理后，接种于血平板、巧克力平板、麦康凯平板。痰中的致病菌不少属于条件致病菌，与正常菌群同时存在，在培养报告中应作说明，通常以报告草绿色链球菌和奈瑟氏菌为正常菌群的指标，同时要注明相应菌群的量。上一页下一页返回第8页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四5.浓汁 组织或器官的化脓性感染，其病原菌的来源可分为两类，内源性和外源性。内源性的感染源是炎症局部周围器官中的正常菌群，由于损伤等因素造成正常栖居菌进入无菌状态的组织内发生感染。外源性的感染源是存在于人体外部自然界的微生物，

9、由于外伤和直接接触，外界微生物通过人体表面进入人体，造成感染。1). 革兰氏染色涂片检查：直接涂片可迅速为临床提供最初的诊断依据，对淋病奈瑟菌、产气荚膜梭菌等的诊断有意义。2). 培养与鉴定：通常将标本接种于血平板、麦康凯平板、巧克力平板等三种培养基，疑为厌氧菌感染时还要接种厌氧血平板。3). 对于无菌部位的感染，从分泌物中分离的细菌，一般都有临床意义，按分离鉴定的菌种报告细菌名称及药敏实验结果。上一页下一页返回第9页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四6.便 正常人体的肠道中栖居大量的微生物，组成人体健康极为重要的体内微生态环境，参与营养、消化、吸收等作用。腹泻是因病原菌

10、在肠道内大量繁殖的结果。培养方法：粪便中最常见的病原菌是沙门氏菌与志贺氏菌，因此通常临床标本可接种SS平板即可，如疑为特殊菌种感染要选择相应的选择性培养基，如霍乱弧菌选用TCBS，小肠结肠炎耶尔森氏菌选用NYE琼脂平板或CIN琼脂平板，难辨梭状芽孢杆菌选用CCFA琼脂平板，念珠菌选用TTC沙保罗等。7.穿刺液 穿刺液包括胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液。正常的穿刺液是无菌的，有感染的情况下，只要检出细菌，通常都可视为是病原菌，因此，革兰氏染色直接涂片检查很有意义，只要检出细菌即可诊断感染的类型。培养须做需氧与厌氧培养，而且要同时接种肉汤做增菌培养，根据分离鉴定的细菌选择相应的药敏实验进行报告

11、。 上一页下一页返回第10页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四二 、细菌感染的实验诊断方法（一）显微镜检查 直接显微镜检查是细菌感染实验诊断的基本方法之一，包 括染色和不染色标本检查法。染色法可根据镜下细菌的形 态及染色性做出初步诊断，只对特定样品中的细菌有诊断 价值。1. 革兰染色 革兰染色是诊断细菌感染最简单快速的方法，通 常根据不同的染色性和细菌形态，可以对细菌的种属做出 初步的推测性鉴定。2. 抗酸染色 鉴定结核和麻风等分枝杆菌属细菌的重要方法。3. 墨汁染色 用于检查脑脊液的隐球菌，具有方便、快速、节 约成本等优点。4. 不染色标本直接检查法 主要用于检查细菌的

12、动力及运动状 态。上一页下一页返回第11页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四上一页下一页返回第12页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四（二）病原菌的分离培养1. 很多细菌的形态和染色性缺乏明显特征，仅凭形态学不能做确切的诊断，需经细菌的分离培养，甚至纯培养后，对细菌进行生化和血清学鉴定，方能明确感染的细菌。2. 原则上应对所有送检标本做分离培养，以便获得单个菌落后进行纯培养，从而对细菌做进一步的生物学、免疫学、致病性或细菌的药物敏感性等方面的检查，最终做出确切的报告。3. 细菌培养时应选择适宜的培养基，以便提供特定细菌生长所需的必要条件。分离培养后根

13、据菌落的大小、形态、颜色、表面性状、透明度和溶血性等对细菌做出初步的识别，然后根据生化反应结果及血清学试验对分离菌做出鉴定。上一页下一页返回第13页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四（三）病原菌抗体的检测1. 病原菌侵入机体后，其抗原性物质能刺激机体产生特异 性抗体。存在于血液或其他体液中的特异性抗体，常随 病程的进展发生变化。用已知细菌或其抗原检测病人体 内是否产生了相应的特异性抗体及其量的多少，可作为 某些病原菌感染的辅助诊断。2. 常用的血清学试验包括：玻片或试管凝集试验、沉淀试 验、补体结合试验和冷凝集试验等，可根据病原菌的种 类加以选择。血清学诊断一般适用于病程

14、较长和抗原性 较强的病原菌引起的感染。3. 若以血清学试验结果作为诊断依据时，应在急性期和恢 复期各取一份血清同时检测，恢复期血清效价明显升高4 倍或以上时方有诊断价值。4. 用血清学试验检测特异性抗体对感染性疾病的诊断有两 方面的局限：在疾病的早期，抗体难以检测出来，因此 难以作为早期诊断的依椐;当抗体水平升高时，很难找出 抗体效价与病情之间的关系。上一页下一页返回第14页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四（四）病原菌抗原的检测抗原的检测是用已知的特异性抗体检测未知的细菌抗原成分。这些试验特异、敏感、简便，即使是在采集样品前患者使用了抗生素，对细菌的培养不易成功，但细菌

15、的抗原仍能被检测出来。因此抗原的检测是检查病原菌的常用技术，可直接使用临床标本或在细菌分离培养后进行。上一页下一页返回第15页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四（五）病原菌的核酸检测1. 传统的微生物学鉴定技术主要根据微生物形态学和生化等表型特征来进行。但有些试验耗时长、费用高或难以顺利完成。随着分子生物学技术的发展，多种检测病原菌核酸的实验技术已经被建立。这不但能有助于感染性疾病的确诊，还能确定病原菌的基因型，使微生物学的检测技术从细菌生物学检查进展到细菌分子生物学的鉴定。2. 分子生物学诊断技术常用于检测不能在体外培养或目前的培养技术不敏感、费用高昂或耗时长的病原体。

16、目前常用的方法主要有聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR) 及核酸杂交技术( nucleotide hybridization)包括Southern印迹杂交(Southern blot)、Northem印迹杂交(Northern blot)、斑点杂交(dot blot)和原位杂交(in situ hybridization，ISH)等。上一页下一页返回第16页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四（六）内毒素检测1. 细菌内毒素检查法又称鲎试验法，它是1964年由美国学者Levih和Bang发现，并在1968年正式建立的一种定性或定量检测

17、微量细菌内毒素的分析方法。该法具有灵敏度高、特异性强和操作简便快捷的特点，不仅在药学，而且在微生物学及临床检验等领域应用较为广泛。2. 鲎试验法可广泛用于革兰氏阴性菌感染的快速诊断，可对患者的血液、尿液及脑脊液进行直接检查，有助于临床医生及时发现内毒素疾病，以迅速采取果断的治疗。在公共卫生方面，鲎试验法可对水源、食物、饮料等进行内毒素测定，以便将其控制在规定水平以下，预防疾病。3. 正常人血中内毒素浓度为：0.1 EUml，超过此值即可诊断为内毒素血症。许多研究表明，内毒素与多种疾病密切相关，内毒素血症多随病情恶化而加重，随病情缓解而减轻。因此，内毒素可以作为一个衡量病情和判断预后的参考指标。

18、也可用于临床治疗及判定疗效或筛选恰当药物的指标之一。上一页下一页返回第17页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四第三节细菌的耐药性检测一、细菌耐药性的概念 细菌耐药性( drug resistance):是指细菌对某抗菌药 物的相对抵抗性。指病原体对反复应用的化学治疗药物 敏感性降低或消失的现象。上一页下一页返回第18页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四第三节细菌的耐药性检测二、细菌耐药性的遗传机制（一）天然耐药指细菌对某些抗菌药物的天然耐药，耐药基因源自亲代，由细菌染色体基因决定而且代代相传的耐药性，存在于其染色体上，具有种属特异性，天然耐药性始终如

19、一并可预测。（二）获得耐药获得耐药性指细菌DNA的改变导致其获得耐药性表型。耐药细菌的耐药基因来源于基因突变或获得新的基因，作用方式为接合、转导或转化。可发生于染色体DNA、质粒、转座子等结构基因，也可发生于某些调节基因。获得耐药性大多由质粒介导，但也有染色体介导，如金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药。耐药基因在质粒、转座子和整合子等可移动的遗传元件介导下，进行传播。 上一页下一页返回第19页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四细菌的耐药性天然耐药性与抗菌药物无关，是细菌固有的，在某种抗菌药物发现或产生之前所分离的细菌已对该药已具有耐药性。获得性耐药A 染色体介导的耐药 突变B

20、质粒介导的耐药 转导、转化、接合、易位上一页下一页返回第20页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四细菌耐药性 染色体 染色体耐药性 - 稳定 - 垂直传播 - 无水平传播 (耐药性不会从一种细菌传给另一种细菌) 上一页下一页返回第21页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四细菌耐药性 质粒 质粒的耐药性 不稳定,由于抗生素的使用选择了耐药质粒 - 耐药基因由一个细菌传给另一个细菌, 甚至是不同的细菌上一页下一页返回第22页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四细菌产生耐药的因素人的行为使微生物 适应生存，产生新的防御力 抗菌药物是医院中各

21、类药物使用范围最广；使用频度最高；使用量最大的药物抗菌药物的大量使用和不合理使用使微生物产生耐药性多重耐药菌在全世界播散，使抗微生物化疗失去效力，以致我们的治疗可能又回到了抗菌药物诞生之前的时代上一页下一页返回第23页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四自然状态下，只占极少数（10-510-9）的耐药菌（株）难以与占压倒决大多数的敏感菌（株）竞争：微生态定植位点的竞争、营养物质的竞争及代谢产物的抑制等耐药突变株在所有 当细菌增殖时耐 由于敏感菌被消除细菌群体中均存在 药菌的比例恒定 耐药菌存活增殖抗菌药物选择性压力上一页下一页返回第24页，共41页，2022年，5月20日，

22、17点11分，星期四第三节细菌的耐药性检测三、抗生素的耐药机制 由于细菌的生命周期短、繁殖较快，因此它有很强的适应新环境的能力，接触抗生素时能形成耐药。常见的细菌对抗生素的耐药机制主要有四种 ：（一）膜通透性的降低（二）改变作用靶位（三）分泌各种酶（四）主动外排返回上一页下一页上一页下一页返回第25页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四细菌的耐药机制上一页下一页返回第26页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四第三节细菌的耐药性检测四、细菌耐药性的防治原则（一）合理使用抗菌药物 1.制定抗生素用药常规，供临床选用抗菌药物参考。 2.严格根据适应证选用药物。

23、 3.病人用药前应尽可能进行病原学检测，并进行药敏试验，作为调整 用药的参考。 4.根据PK/PD理论，制定合理的用药方案。（二）严格执行消毒隔离制度，对耐药菌感染的患者应予隔离，防止耐药菌的交叉感染。（三）加强药政管理 1.加强细菌耐药性的检测，建立细菌耐药监测网，掌握本地区、本单 位重要致病菌和抗菌药物的耐药性变迁资料，及时为临床提供信息。 2.必须规定抗菌药物凭处方供应。 3.畜牧业应尽量避免供临床使用的抗菌药物作为动物生长促进剂或治疗， 以避免对医用抗菌药物产生耐药性。（四）研发新抗菌药物上一页下一页返回第27页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四第三节细菌的耐药性

24、检测五、抗生素敏感试验（一）概念最小抑菌浓度（MIC minimal inhibitory concentration）:能够抑制99.9%细菌生长的最小抗生素浓度。最小杀菌浓度（MBC minimal bactericidal concentration）能够杀死99.9%的细菌的最小抗生素浓度。（二）试验方法稀释法纸片扩散法其他上一页下一页返回第28页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四Broth dilution testTube dilution test for determining the minimum inhibitory concentration (M

25、IC).上一页下一页返回第29页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四Disk diffusion test上一页下一页返回第30页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四第三节细菌的耐药性检测六、临床常见的耐药菌株耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）耐青霉素的肺炎链球菌耐万古霉素的肠球菌耐万古霉素的金黄色葡萄球菌产ESBLs的革兰氏阴性杆菌高产AmpC酶的革兰氏阴性杆菌泛耐药的铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌产NDM-1的超级细菌上一页下一页返回第31页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四第四节侵袭性真菌病的实验诊断一、真菌感染的类型 自然界存在的真

26、菌超过一百万种，但仅有400种真菌能导致人类、动物或植物患病。虽然真菌在环境中普遍存在，并且是构成正常人类微生物菌群的一部分，但是由于免疫系统的防御作用，真菌在健康人群中极少导致疾病。根据真菌病的感染部位可以分为以下几类：浅表真菌病皮下真菌病全身性或侵袭性真菌感染上一页下一页返回第32页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四第四节侵袭性真菌病的实验诊断二、侵袭性真菌感染的危险因素（一）长期应用广谱抗生素。（二）免疫抑制性治疗：免疫抑制剂、糖皮质激素、恶性肿瘤 患者、器官移植患者、化疗、放疗。（三）免疫抑制性疾病：中性粒细胞减少、艾滋病。（四）体内留置导管：中心静脉插管、肠外静

27、脉营养、气管插 管、放置尿管、机械通气（五）免疫功能低下的患者：糖尿病、新生儿、肾功能衰竭、 血液透析、营养不良。上一页下一页返回第33页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四第四节侵袭性真菌病的实验诊断三、侵袭性真菌感染的流行病学（一）念珠菌感染（二）曲霉菌感染（三）毛霉菌感染（四）隐球菌感染（五）组织胞浆菌感染上一页下一页返回第34页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四第四节侵袭性真菌病的实验诊断四、侵袭性真菌病临床诊断新进展 IFI的诊断由宿主因素、临床特征、组织病理学和真菌学检查四方面构成，按国外指南分为确诊、临床诊断及拟诊三个层次。其中确诊主要依

28、据组织病理学或血液、胸腔积液等的真菌培养阳性为主要依据。（一）侵袭性真菌病的临床诊断标准1.确诊IFI：组织学证据。2.临床诊断IFI：符合1项宿主因素、1项主要临床表现或2项次要临床表现及1项微生物学证据。3.拟诊IFI：1项宿主因素及1项微生物学标准或2项次要临床标准。上一页下一页返回第35页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四（二）实验室诊断应用真菌培养：仍然是确诊的金标准。 直接镜检：墨汁染色及真菌涂片检查。 血清学诊断方法：是应用免疫方法检测血清或其它体液中真菌细胞壁和胞质的成分。由于IFI多继发于严重免疫受损患者，往往缺乏可检测到的抗体，所以检测真菌抗原成为目前

29、实验室诊断的发展方向。 1）GM试验 2）G试验上一页下一页返回第36页，共41页，2022年，5月20日，17点11分，星期四GM试验 GM是曲霉菌细胞壁的成分，最初是从感染动物模型和侵袭性曲霉病患者血清中发现。当曲霉感染时，血液及体液（尿液、脑脊液、腹水、胸水）中会显著增高。在感染早期血清中就能够检测出GM，而且常常早于临床症状和影像学特征出现，研究显示有2/3的患者在其它方法诊断侵袭性曲霉病前614天即可检测到GM，连续动态监测（每周2次）对高危患者具有早期诊断价值。 GM试验的Cutoff值为0.5时敏感性增高，有利于早期诊断，但是特异性相对较差，有可能出现假阳性，其原因主要是一些抗原物质与单克隆抗体产生交叉反应所致。例如：1） 哌拉西林/他唑巴坦的应用。2） 胃肠黏膜损伤时谷类食物中的GM抗原通过肠道入血，胃肠外营养时 营养液中的某些成分也会与GM产生交叉反应。3） 母乳或配方食