食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验

1、 PAGE 12 GB 4789.40-2010食品安全国家标准食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验范围本标准规定了食品中克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）的检验方法。本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中克罗诺杆菌属的检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：25 1 ，36 1 ，44 0.5 。2.2 冰箱：2 5 。2.3 恒温水浴箱：44 0.5 。2.4 天平：感量0.1 g。2.5 均质器。2.6 振荡器。2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或

2、微量移液器及吸头。2.8 无菌锥形瓶：容量100 mL、200 mL、2 000 mL。2.9 无菌培养皿：直径90 mm。2.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.11 全自动微生物生化鉴定系统。2.12 PCR仪。2.13 荧光PCR仪。2.14 离心机。2.15 紫外凝胶成像仪。2.16 电泳仪2.17 移液器：2L10L、10L100L、20L200L、100L1 000L.3 培养基和试剂3.1 缓冲蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）：见附录A中A.1。3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tr

3、yptose broth-vancomycin medium， mLST-Vm）：见附录A中A.2。3.3 阪崎肠杆菌显色培养基。3.4 胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar，TSA）：见附录A中A.3。3.5 生化鉴定试剂盒。3.6 氧化酶试剂：见附录A中A.4。3.7 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A中A.5。3.8 L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A中A.6。3.9 L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A中A.7。3.10 糖类发酵培养基：见附录A中A.8。3.11 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A中A.9。3.12 普通PCR引物CronoF:5-GGGTTGTCTGCGA

4、AAGCGAA-3；CronoR：5-GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3。3.13 Taq DNA 聚合酶。3.14 荧光PCR引物CronoRTF: 5-GGCGAGCGGCGAATATTAT-3； CronoRTR: 5-CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC-33.15 探针：5-FAM-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-BHQ-33.16 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。3.17 Ex Taq DNA聚合酶3.18 10PCR缓冲液。3.19 克罗诺杆菌属质控菌株：ATCC 29544，或等效菌株。3.20 DNA提取试剂：细菌基因组DNA提

5、取试剂盒。3.21 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、1 mmol/L EDTA（pH8.0）。3.22 琼脂糖：分析纯。3.23 核酸染色剂。3.24 分子量标记：100 bp DNA ladder。3.25 5TBE电泳缓冲液：Tris 54 g、硼酸27.5 g、0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，加蒸馏水至1 000 mL，使用时稀释为0.5TBE电泳缓冲液。3.26 6加样缓冲液。3.27 FastStarUniversal Probe Master（2）第一法 克罗诺杆菌属的检验4 检验程序克罗诺杆菌属检验程序见图1。检样100 g（

6、mL）检样100 g（mL）+BPW稀释液900 mL36 36 1 ，18 h2 h1 mL1 mL + mLST-Vm 10 mL44 44 0.5 ，24 h2 h阪崎肠杆菌显色培养基阪崎肠杆菌显色培养基36 36 1 ，24 h2 h挑取疑似菌落挑取疑似菌落TSATSA25 25 1 ，48 h4 hPCR检测（选作）或荧光PCR检测（选作）挑取黄色菌落PCR检测（选作）或荧光PCR检测（选作）挑取黄色菌落生化鉴定生化鉴定报 告报 告图1 克罗诺杆菌属检验程序5 操作步骤5.1 前增菌和增菌 取检样100 g（mL）加入已预热至44 装有900 mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇

7、动至充分溶解，36 1 培养18 h2 h。移取1 mL转种于10 mL mLST-Vm肉汤，44 0.5 培养24 h2 h。5.2 分离5.2.1 轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，36 1 培养24 h2 h。5.2.2 挑取1个5个可疑菌落，划线接种于TSA平板。25 1 培养48 h4 h。5.3 鉴定自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。克罗诺杆菌属的主要生化特征见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。表1 克罗诺杆菌属的主要生化特征生化试验特 征黄色素产生氧化酶L-赖氨酸脱羧酶L-鸟氨酸脱

8、羧酶（）L-精氨酸双水解酶柠檬酸水解（）发酵D-山梨醇（）L-鼠李糖D-蔗糖D-蜜二糖苦杏仁甙 注：99%阳性；99%阴性；（）90%99%阳性；（）90%-99%阴性。5.4 PCR法（选作）5.4.1 模板DNA提取从TSA平板选取菌落，按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA，所提取的模板DNA溶于50 L TE中。5.4.2 PCR扩增5.4.2.1 反应体系体积为50 L：10PCR缓冲液5 L、上游引物和下游引物（10 mol/L）各2 L、dNTP（10 mmol/L）1 L、TaqDNA聚合酶（5U/L）0.5 L、水38.5 L、模板DNA 1 L。5.4.2.2

9、 反应条件：94预变性5 min，94变性30 s，57退火30 s，72延伸30 s，进行35个循环，72延伸5 min，4下保存。5.4.3 质控检测过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。分别接种克罗诺杆菌和大肠杆菌到10 mL BHI中，361过夜培养，各取1.5 mL增菌液，离心，提取DNA模板。克罗诺杆菌DNA模板作阳性对照，大肠杆菌DNA模板作阴性对照，空白对照以无菌水作为模板，加样量与样品加样量一致。5.4.4 PCR扩增产物电泳检测用0.5TBE电泳缓冲液配置1.5%琼脂糖电泳凝胶并趁凝胶未凝固时加入溴化乙锭使其最终浓度达到1 g/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面

10、没过胶面。将适量PCR扩增产物分别和相应的6加样缓冲液混合，点样，其中一孔加入100 bp DNA ladder。90 V/cm恒压，电泳20 min30 min。紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。5.5 PCR结果及判断5.5.1 PCR扩增产物电泳检测结果克罗诺杆菌属PCR扩增产物为282 bp，序列信息参见附录C。5.5.2 对照结果5.5.2.1 阴性对照未出现预期大小的扩增条带。5.5.2.2 空白对照未出现预期大小的扩增条带。5.5.2.3 阳性对照出现预期大小的扩增条带。5.5.2.4 以上指标有一项不符合均视为此次实验无效。5.5.3 结果判定5.5.3.1 待测样

11、品出现预期大小的扩增条带，为阳性结果。5.5.3.2 待测样品未出现预期大小的扩增条带，为阴性结果。5.6 荧光PCR法5.6.1 模板DNA提取从TSA平板选取菌落，按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA，所提取的模板DNA溶于50 L TE中。5.6.2 荧光PCR扩增 反应体系总体积为25 L，其中含：上游引物和下游引物（10 mol/L）各0.4 L、FastStartUniversal Probe Master（2）12.5L、探针（10 mol/L）0.2 L、模板DNA 2 L，ddH2O补齐至25 L。反应条件：95预变性10 min，95变性5 s，55退火20

12、 s，收集荧光信号，进行40个循环，反应产物4保存。检测过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。克罗诺杆菌属DNA模板作阳性对照，大肠杆菌DNA模板作阴性对照，空白对照以无菌水作为模板，加样量与样品加样量一致。6 结果与报告6.1 综合菌落形态和生化特征，报告每100 g（mL）样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。6.2 检测样本Ct值小于或等于35.0时，报告克罗诺杆菌属筛选阳性；检测样本Ct值大于35.0时且小于40.0时，重复一次，如果Ct值仍小于40，且曲线有明显的对数增长期，可报告克罗诺杆菌属筛选阳性，否则报告克罗诺杆菌属未检出；样本检测不到Ct值时，报告克罗诺杆菌属未检出。 第二法 克

13、罗诺杆菌属的计数7 操作步骤7.1 样品的稀释7.1.1 固体和半固体样品：无菌称取样品100 g、10 g、1 g各三份，加入已预热至44 分别盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW中，轻轻振摇使充分溶解，制成1:10样品匀液，置36 1 培养18h2h。分别移取1 mL转种于10 mL mLST-Vm肉汤，44 0.5 培养24h2h。7.1.2 液体样品：以无菌吸管分别取样品100 mL、10 mL、1 mL各三份，加入已预热至44 分别盛有900 mL、90 mL、9 mL BPW中，轻轻振摇使充分混匀，制成1:10样品匀液，置36 1 培养18h2h。分别移取1 mL转种于1

14、0 mL mLST-Vm肉汤，44 0.5 培养24 h2 h。7.2 分离、鉴定同5.2-5.3。8 结果与报告综合菌落形态、生化特征，根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数，查MPN检索表，报告每100 g（mL）样品中克罗诺杆菌属的MPN值（见附录中表B.1）。附 录A培养基和试剂缓冲蛋白胨水（BPW）成分蛋白胨10 .0g氯化钠5.0 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）9.0 g磷酸二氢钾1.5 g蒸馏水1 000 mLpH 7.2制法加热搅拌至溶解，调节pH，121 高压灭菌15 min。改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modified lauryl sulfate tryp

15、tose broth-vancomycin medium，mLST-Vm）改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST）肉汤成分氯化钠34.0 g胰蛋白胨20.0 g乳糖5.0 g磷酸二氢钾2.75 g磷酸氢二钾2.75 g 十二烷基硫酸钠0.1 g蒸馏水1 000 mLpH 6.80.2制法加热搅拌至溶解，调节pH。分装每管10 mL，121 高压灭菌15 min。万古霉素溶液成分万古霉素10.0 mg蒸馏水10.0 mL制法10.0 mg万古霉素溶解于10.0 mL蒸馏水，过滤除菌。万古霉素溶液可以在0 -5 保存15天。改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modified lauryl sul

16、fate tryptose broth-vancomycin medium，mLST-Vm）每10 mL mLST加入万古霉素溶液0.1 mL，混合液中万古霉素的终浓度为10 g/ mL。注意：mLST-Vm必须在24 h之内使用。胰蛋白胨大豆琼脂（TSA） 成分胰蛋白胨15.0 g植物蛋白胨 5.0 g氯化钠5.0 g琼脂15.0 g蒸馏水1 000 mLpH 7.30.2 制法加热搅拌至溶解，煮沸1 min，调节pH，121 高压15 min。氧化酶试剂 成分N，N，N，N-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0 g蒸馏水100 mL 制法少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在7 d之内使用。 试验方法用

17、玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10 s中之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶实验阳性。注意：实验中切勿使用镍/铬材料。L-赖氨酸脱羧酶培养基 成分L-赖氨酸盐酸盐（L-lysine monohydrochloride）5.0 g酵母浸膏3.0 g葡萄糖1.0 g溴甲酚紫0.015 g蒸馏水1 000 mLpH 6.80.2 制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5 mL，121 高压15 min。 实验方法挑取培养物接种于L-赖氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 1 培养24 h2 h，观

18、察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。L-鸟氨酸脱羧酶培养基 成分L-鸟氨酸盐酸盐（L-ornithine monohydrochloride）5.0 g酵母浸膏3.0 g葡萄糖1.0 g溴甲酚紫0.015 g蒸馏水1 000 mLpH 6.80.2 制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5 mL。121 高压15 min。 实验方法挑取培养物接种于L-鸟氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 1 培养24 h2 h，观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。L-精氨酸双水解酶培养基 成分L-精氨酸盐酸盐（L-arginine

19、 monohydrochloride）5.0 g酵母浸膏3.0 g葡萄糖1.0 g溴甲酚紫0.015 g蒸馏水1 000 mLpH 6.80.2 制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5 mL。121 高压15 min。 实验方法挑取培养物接种于L-精氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 1 培养24 h2 h，观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。糖类发酵培养基 基础培养基成分酪蛋白（酶消化）10.0 g氯化钠5.0 g酚红0.02 g蒸馏水1 000 mLpH 6.80.2制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5 mL。121 高压1

20、5 min。 糖类溶液（D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙）成分糖8.0 g蒸馏水100 mL制法分别称取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各8 g，溶于100 mL蒸馏水中，过滤除菌，制成80 mg/mL的糖类溶液。 完全培养基成分基础培养基875 mL糖类溶液125 mL制法无菌操作，将每种糖类溶液加入基础培养基，混匀；分装到无菌试管中，每管10 mL。 实验方法挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 1 培养24 h2 h，观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。西蒙氏柠檬酸盐培养基 成分柠檬

21、酸钠2.0 g氯化钠5.0 g磷酸氢二钾1.0 g磷酸二氢铵1.0 g硫酸镁0.2 g溴百里香酚蓝0.08 g琼脂8.018.0g蒸馏水1 000 mLpH 6.80.2 制法将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装10 mL，121 高压15 min，制成斜面。 实验方法挑取培养物接种于整个培养基斜面，36 1 培养24 h2 h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。附 录B克罗诺杆菌属最可能数（MPN）检索表B.1 克罗诺杆菌属最可能数（MPN）检索表每100 g（mL）检样中克罗诺杆菌属最可能数（MPN）的检索见表B.1。表B.1 克罗诺杆菌属最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN95%可信限阳性管数MPN95%可信限100101下限上限100101下限上限0000.3-0.952202.10.454.20010.30.0150.962212.80.879.40100.30.0151.12223.50.879.40110.610.121.82302.90.879.40200.620.121.82313.60.879.40300.940.363.83002.30.469.41000.360.0171.83013.80.87111010.720.131.83026.41.7181021.10.363.83104.30.9181100.740.1323117.51.72011