毕业论文-SALL4与Glypican3在儿童卵黄囊瘤中的表达及意义

1、温州医科大学硕士学位论文 .将切片按顺序置于75无水乙醇一85无水乙醇一95无水乙醇一无水乙醇一二甲苯I一二甲苯。无水乙醇中为5min，二甲苯为15min。最后将切片平铺于纸上，滴上中性树胶，盖上盖玻片，进行封片,不能等二甲苯完全干了后再去封片，否则切片中容易出现色素沉着，影响结果的判定，封好后的切片静置24小时以上，三天后观察染色结果。2.4 免疫组化结果判定及标准Proteintech提供的抗体，SALL4 蛋白位于细胞核内,GPC3蛋白位于细胞质或细胞膜上,AFP蛋白位于细胞质或细胞膜上。阳性表现为细胞核、细胞浆、细胞膜出现棕黄色，将切片置于光学显微镜下（400）下观察，随机观察5个视野

2、，取平均值，以每一张切片内着色的阳性细胞占所有肿瘤细胞的比例为主要观察对象。判断标准：根据阳性细胞占所有肿瘤细胞的比例来分为四级，不显色或阳性细胞90%或弥漫成片为(+)。统计学分析应用SPSS 17.0统计分析软件分析，多组间等级资料比较先采用Kruskal-Wallis H整体检验后，如各组间存在统计学差异，多组间等级资料两两比较再采用Nemenyi检验，P0.05为差异有统计学意义。结 果 2.1 儿童卵黄囊瘤HE染色组织病理学结构对儿童卵黄囊瘤组织行常规组织学检查，HE染色可见组织在镜下具有以下形态：壁层分化较好的细胞大多呈圆形、多边形，胞浆多而亮，可以排列成疏松网状、实性细胞结构等，

3、细胞间可见均质红染的呈基底膜样物质，尤其是在实性区。脏层细胞一般分化较好，呈现立方形，可形成网状结构、腺样结构等。上述两种成分混杂，在组织中可见以下结构：疏松网状结构，也叫微囊性结构，是织结构中最常见类型，大多由肿瘤细胞的胞浆通过相互交连而形成的蜂窝状结构（见图1-A）。乳头状结构，多数单一的血管外圆形或高柱形细胞构成，血管间隙可见散在分布的透明小体(见图1-B )。实性细胞结构是由核分裂程度活跃的多角形上皮样细胞聚集而成(见图1-C)。腺样结构则是由形态迥异的各种管道样结构和囊样结构组成，外层包被结缔组织，形成的多囊形结构(见图1-D )。AFP在儿童卵黄囊瘤中的阳性表达率为90%，且表达多

4、为局灶性表达，多见于疏松网状结构和腺样结构（见图2 表3）。2.2 SALL4在儿童卵黄囊瘤和成熟畸胎瘤、睾丸间质细胞瘤中的表达情况22例儿童卵黄囊瘤中SALL4的阳性表达率为100%，表达强度为19例（+），3例（+），而且在卵黄囊瘤的疏松网状、乳头状、实性细胞、腺样等组织结构中均有较强的阳性表达（见表1图3 A、B、C、D）。SALL4在儿童成熟畸胎瘤中未见阳性表达(见表1图4)，在儿童睾丸间质细胞瘤中也未见表达(见表1 图5表1 SALL4在儿童卵黄囊瘤和成熟畸胎瘤、睾丸间质细胞瘤中的表达-+卵黄囊瘤0003（13.6%）19（86.4%）成熟畸胎瘤10（100%）0000间质细胞瘤1

5、（100%）00002.3 GPC3在儿童卵黄囊瘤和成熟畸胎瘤、睾丸间质细胞瘤中的表达情况GPC3在儿童卵黄囊瘤中的阳性表达率为100%，强度为8例（+），6例（+），5例（+），3例（+），GPC3 大多在卵黄囊瘤的疏松网状结构和腺样结构中有较强的阳性表达（见表2 图6 A、B、C、D）。GPC3在儿童成熟畸胎瘤中的表达为9例（-），1例（+）(见表2 图8)。GPC3在儿童睾丸间质细胞瘤中的表达为阴性(见表2 图7表2 GPC3在儿童卵黄囊瘤和成熟畸胎瘤、间质细胞瘤中的表达-+卵黄囊瘤03（13.6%）5（22.7%）6（27.3%）8（36.4%）成熟畸胎瘤9（90%）1（10%）000

6、间质细胞瘤1（100%）00002.4 SALL4 和GPC3、AFP 在儿童卵黄囊瘤中表达强度的比较分析 SALL4在儿童卵黄囊瘤中的阳性表达强度为19例(+)、3例(+)；GPC3在儿童卵黄囊瘤中的阳性表达强度为8例(+)、6例（+）、5例（+）、3例(+)，而AFP在儿童卵黄囊瘤中的表达强度为7例(+)、8例(+)、6例(+)、1例(-)。SALL4与AFP在儿童卵黄囊瘤中表达强度的比较有显著性差异(P0.05)(见表3图9)。GPC3与AFP在儿童卵黄囊瘤中表达强度的比较有显著性差异(P0.05)(见表3 图10)。SALL4 和GPC3在儿童卵黄囊瘤中表达强度的比较有显著性差异(P0

7、.05)(见表3 图11)。表3 SALL4、GPC3和AFP在儿童卵黄囊瘤中表达强度的比较-+SALL40003（13.6%）19（86.4%）GPC303（13.6%）5（22.7%）6（27.3%）8（36.4%）AFP1（4.5%）6（7.3%）8（36.4%）7（31.8%）0注：各组间整体比较用Kruskal-Wallis H检验后，各组间两两比较采用Nemenyi 检验。SALL4和AFP在儿童卵黄囊瘤表达强度的比较中，P0.05；GPC3和AFP在儿童卵黄囊瘤表达强度的比较中，P0.05；SALL4和GPC3在儿童卵黄囊瘤表达强度的比较中，P0.05。讨 论恶性生殖细胞肿瘤是一

8、类极其罕见且具有异质性的肿瘤，在儿童肿瘤中仅占3% ADDIN KyMedRef2008REF:REF48061A9D-48D8-4A48-AF3D-AD6FE88765A011。卵黄囊瘤作为儿童期最常见的恶性生殖细胞肿瘤，一般多见于3岁以内的婴幼儿 ADDIN KyMedRef2008REF:REF5C6FEEC6-4727-4CB0-90AA-56A74AEA55A912。作为一种来源于胚胎期卵黄囊的恶性肿瘤，将近75%的卵黄囊瘤发生在性腺（睾丸和卵巢），其中大多数好发于儿童睾丸；性腺外的骶尾部、纵隔、腹膜后、阴道等部位也时有发生，但发生的比例较小，而且发生部位一般都靠近人体中线13。卵黄

9、囊瘤恶性程度高，容易发生血性转移，预后较差。卵黄囊瘤是儿童恶性生殖细胞肿瘤中恶性程度最高的一种，它的产生与原始生殖细胞的发育和分化密切相关。原始生殖细胞祖细胞最早出现于胚胎第四周的卵黄囊，然后在胚胎发育的过程中，如果受到如遗传、物理、化学等方面因素的影响，生殖细胞将会产生恶变，出现向不同胚层发育的现象，偏离原来正常发育路径。最终可以形成以下几种主要类型：保留原始生殖细胞的形态和功能，形成分化程度最低的胚胎癌;向外胚层分化发展，形成卵黄囊瘤；向三个胚层分化发展，形成含有三个胚层结构的成熟畸胎瘤。综上所述，生殖细胞肿瘤是起源相同，只是在分化程度和方向上稍有区别的一类肿瘤。卵黄囊瘤作为恶性程度最高的

10、一类生殖细胞肿瘤，不但它的一些诸如管状、腺样、网状等结构极易被误认为成熟畸胎瘤14,15，而且在组织形态学方面，和其他生殖细胞肿瘤也具有一定的相似性，仅仅依靠常规的HE染色方法辨认，难度比较大。再则卵黄囊瘤和成熟畸胎瘤是两种性质不同的肿瘤，卵黄囊瘤高度恶性，极易转移，预后较差；成熟畸胎瘤是良性的儿童生殖细胞肿瘤，预后较好。鉴于此，在儿童卵黄囊瘤的诊断过程中，引入敏感性和特异性较好的肿瘤标记物就显得尤为关键。 在卵黄囊瘤的临床诊断过程中，甲胎蛋白是最常用的一类肿瘤标记物，数十年间，AFP一直被奉作诊断卵黄囊瘤的金标准16，沿用至今。然而随着科学研究的不断深入，越来越多的人意识到血清AFP水平的升

11、高并不能很好的反映体内是否存在相关分泌AFP的肿瘤，而且AFP的升高不但会出现在肝母细胞癌、子宫浆液性癌、胃腺癌等肿瘤中17,18,19,20，而且有时也会受到生理状态的影响，一岁以内的婴幼儿，此时体内仍有生理性的AFP升高，新生儿含量更高，可达50000ng/mL，2个月后降至300ng/mL，但一般在1岁左右才能降至正常21，但是儿童卵黄囊瘤一般好发于3岁以内婴幼儿，因此当卵黄囊瘤发生于较小婴幼儿时，尤其是一岁以内的婴幼儿，AFP监测的意义有限，不一定能反映患儿的真实病情。有相关报道称，在研究性腺外卵黄囊瘤的过程中发现，血清AFP水平无明显变化，因此AFP在诊断性腺外的卵黄囊瘤过程中，当卵

12、黄囊瘤发生转移时，诊断价值有限。AFP一般在细胞质中显色，在卵黄囊瘤的疏松网状结构和腺样结构中一般有局灶性的阳性表达，在透明小体中几乎为阴性表达。所以当患儿年龄偏小，特别是一岁以内时，要结合患儿生理情况加以分析。当儿童无痛性肿块原发于性腺外，合并血清AFP监测为阴性时，要高度警惕肿块可能是卵黄囊瘤。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3，GPC3 )是一种仅在滋养层和胎儿组织中表达的蛋白，相关研究证明GPC3在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤等组织中的表达为阴性，而在肝母细胞瘤、睾丸生殖细胞肿瘤等中的表达明显增加。本次试验中GPC3与AFP相比，GPC3在卵黄囊瘤中的表达情况为8例（+），6例

13、（+），5例（+），3例（+），AFP在卵黄囊瘤瘤中的表达情况为7例(+)、8例(+)、6例(+)、1例(-)，两者相比，GPC3在卵黄囊瘤中的表达的阳性率相对较高，GPC3的敏感性显著高于AFP，而且表达强度显著高于AFP(见图10 表3)。Zynger等22的研究也证实GPC3在卵黄囊瘤中的表达及其敏感性较AFP显著。本次实验中GPC3 在成熟畸胎瘤中表达阳性率为90%，仅有的1例表达强度为1+，表达量较低，而在卵黄囊瘤中的表达阳性率为100%，且表达强度普遍在2+以上，这一现象提示我们GPC3的表达可能与生殖细胞肿瘤的分化程度相关。卵黄囊瘤虽然为高度恶性的生殖细胞肿瘤，但是其通常具有很好

14、的分化，且儿童期的卵黄囊瘤通常以单纯性组织成分存在。Zynger等23的研究也证实分化程度最低的胚胎癌和精原细胞瘤几乎不表达GPC3，而卵黄囊瘤全部表达GPC3,只有少部分的成熟畸胎瘤表达GPC3。造成这一现象的合理解释可能是，所有的生殖细胞肿瘤具有共同的起源，GPC3可能参与了生殖细胞向外胚层特异性分化的过程，但具体机制还有待于进一步的研究证实。GPC3一般在胞质和胞膜中表达，在卵黄囊瘤的疏松网状结构和腺样结构中一般有较强的阳性表达，在卵黄囊瘤的其他结构中表达强度较弱。上述的实验研究证实GPC3对卵黄囊瘤和成熟畸胎瘤的区分具有一定的作用。有报道称，GPC3在诊断卵黄囊瘤方面的特异性较差，因为

15、它在女性生殖道、未成熟畸胎瘤的神经组织、胎盘滋养细胞肿瘤等一些组织中皆有表达24，但GPC3与AFP相比，在诊断儿童卵黄囊瘤方面，仍具有很强的敏感性，而且在成人组织中几乎不表达， GPC3仍然可以作为诊断和区分生殖细胞肿瘤的辅助手段。SALL4是一种干细胞转录因子，主要在胚胎发育的早期起作用。SALL4同OCT4、NANOG、Sox2一起组成维持胚胎干细胞自我更新和多能性核心的网络。它们同属于胚胎干细胞的标记物，在诊断生殖细胞肿瘤方面皆具有一定的价值。OCT4，多能性因子八聚物结合转录因子，Jones等25的研究证实，OCT4对睾丸精原细胞瘤的诊断具有相当大的价值，但在卵黄囊瘤和畸胎瘤中的表达

16、却不高。Hattab 等26的研究也发现OCT4在诊断睾丸生殖细胞肿瘤时比胎盘碱性磷酸酶有更高的特异性和敏感性，但对睾丸卵黄囊瘤的诊断意义不大。NANOG一种具有胚胎干细胞特异性蛋白，常常与睾丸的发育相关，应用于睾丸原位癌、胚胎癌、精原细胞瘤的诊断，但对畸胎瘤和卵黄囊瘤的诊断价值有限27。Sox2主要表达于胚胎癌和非精原细胞瘤的未分化部分，但在精原细胞瘤、卵黄囊瘤中的表达却为阴性28。在生殖细胞肿瘤非精原细胞瘤诊断中，比如卵黄囊瘤和绒癌，上述四种胚胎干细胞标记物的表达有且仅有SALL4的表达为阳性，在卵黄囊瘤诊断上具有一定的价值。lin28是一种mRNA结合蛋白，作为一种多能性的干细胞因子，一

17、般在卵黄囊发育的第五周开始表达，在七到八周的时候，表达会有所下调，这反映了内胚层细胞的终极分化程度。同上边三种标志物一样，也属于转录调控因子，可以调控胚胎干细胞的多能性，lin28主要位于胞质。West等在研究中发现LIN28在原始生殖细胞的发展和恶化的过程中起到关键的作用，lin28主要表达在睾丸原位癌、精原细胞瘤、卵黄囊瘤、胚胎癌29。由于lin28在上述生殖细胞肿瘤中皆有强的阳性表达，所以对于卵黄囊瘤的诊断而言，lin28特异性不高。SALL4是一种蛋白转录因子，位于人类染色体20q131313.2，是果蝇同源异型基因SAL /Spalt在人类基因中的同系物，在胚胎发育头和尾的过程中起着

18、关键作用30。在哺乳动物体内，SALL家族共有SALL1-4四个成员，在小鼠胚胎发育过程中，SALL4的突变可能会导致小鼠胚胎早期发育不全;在人类的胚胎发育过程中，SALL4的突变会导致心脏和肾脏的畸形。大量的研究证实，人类SALL4基因发生突变时，会发生常染色体显性遗传病Okihiro综合征、雅一肾一眼综合征、IVIC综合征31。SALL4与OCT4、NANOG、Sox2一起构成调控环路，可以调控胚胎干细胞的多能性和自我更新能力。在本次实验中，SALL4在22例儿童卵黄囊瘤标本中的表达情况为，19例(+)、3例(+)（见表1 图3 ），AFP在22例卵黄囊瘤标本中的表达情况为7例(+)、8例

19、(+)、6例(+)、1例(-)（见表3 图2 ）。两者相比，就SALL4 与AFP在儿童卵黄囊瘤表达强度方面，差异有统计学意义(见表3 图9)，籍此证明SALL4在儿童卵黄囊瘤中的阳性表达强度更高。SALL4在22例儿童卵黄囊瘤中的表达为全阳性，呈弥漫性表达，胞核染色，在卵黄囊瘤的各种组织学结构中，如网状结构、乳头状结构、实性细胞结构、腺样结构等均有较强染色，便于观察阳性结果，明确卵黄囊瘤的诊断。Cao等的研究32也证实，90%的小管内生殖细胞癌、胚胎癌、卵黄囊瘤（包括儿童期和青春期后）表达SALL4，而在一些畸胎瘤中很少表达。Cao等的相关研究33也证实SALL4不但在诊断精原细胞瘤，胚胎癌

20、，卵黄囊瘤具有100%的敏感性，而且对转移后的生殖细胞肿瘤仍具有监测的作用。因此SALL4诊断儿童卵黄囊瘤的敏感性比AFP高。GPC3在儿童卵黄囊瘤中的表达强度也较高，阳性率高于强于AFP,但与SALL4就诊断卵黄囊瘤方面作比较，SALL4的表达强度高于GPC3（见表3 图11）。Zynger等的研究34发现，卵黄囊瘤在形态学上与胚胎癌具有极其相似的结构，在临床上极难区分，而GPC3在卵黄囊瘤中几乎全表达，而在90%的胚胎癌中几乎不表达。Wang等人的研究35也证实，GPC3有助于生殖细胞肿瘤的亚型卵黄囊瘤和胚胎癌的鉴别诊断。上述报道提示我们，由于SALL4与GPC3在诊断卵黄囊瘤中的敏感性相

21、当，二者相结合，不但可以提高卵黄囊瘤诊断的准确率，而且可能在生殖细胞肿瘤的鉴别诊断中具有一定的价值。本实验最后还比较了SALL4、GPC3在1例儿童睾丸间质细胞瘤中的表达情况，表达全为阴性。睾丸间质细胞瘤例数较少，统计学意义有限。综上所述，SALL4与GPC3在儿童卵黄囊瘤的诊断上，阳性率均强于AFP，三者相比，SALL4在卵黄囊瘤中的表达强度最高。SALL4在儿童卵黄囊瘤中表达强度高，而在儿童成熟畸胎瘤和睾丸间质细胞瘤中几乎不表达，所以就诊断儿童生殖细胞肿瘤方面的特异性而言，SALL4和AFP相当，所以SALL4是一个敏感性和特异性都非常好的生殖细胞肿瘤标记物，尤其在儿童恶性生殖细胞肿瘤卵黄

22、囊瘤的诊断上。GPC3在儿童卵黄囊瘤中的表达强度较高，而在成熟畸胎瘤中的几乎不表达，这暗示我们GPC3可能与生殖细胞肿瘤的分化程度相关，由于本院归档的近十年的儿童生殖细胞肿瘤病理标本中尚未发现儿童胚胎癌的病理类型，所以本研究存在一定的局限性。综上所述，SALL4在儿童卵黄囊瘤诊断上具有很高的敏感性，特异性也较好，表达强度显著高于GPC3和AFP，可能会成为诊断儿童卵黄囊瘤的一项新的免疫组化指标。GPC3对儿童生殖细胞肿瘤的分化程度有一定的提示作用，可能会在临床上有一定的指导意义。GPC3与SALL4联合诊断儿童生殖细胞肿瘤，可能会提高儿童卵黄囊瘤诊断的准确率，对儿童生殖细胞肿瘤的分型可能会具有

23、一定的意义。但是值得指出的是，本次研究存在一定的局限性：1.收集到的样本量（n=22）较少，在一定程度上影响了上述检测指标结果的比较，使得实验结果的说服力有所降低。2.本次研究主要应用免疫组化的方法来检测相关蛋白的表达水平，缺乏定量检测手段如WB、RT-PCR，降低了实验结果的说服力；3.本次研究只对儿童卵黄囊瘤石蜡标本中上述蛋白的表达水平进行了初步分析，缺乏一定的干预手段和动物体内实验。结 论l.在儿童常见的生殖细胞肿瘤中，SALL4 与 Glypican3在儿童卵黄囊瘤中均有较强的阳性表达率。通过对SALL4、Glypican3和AFP 在儿童卵黄囊瘤中的免疫组化染色分析，结合SALL4在

24、儿童常见生殖细胞肿瘤中的表达可知，SALL4有可能会成为诊断儿童卵黄囊瘤的新的免疫组化指标。SALL4与Glypican3联合诊断儿童生殖细胞肿瘤，可能会提高儿童卵黄囊瘤的诊断，有可能在儿童生殖细胞肿瘤的鉴别诊断上发挥一定的作用AB 附图ABCCFig1.The histologic appearance of YST of childrenA: loose reticular network(网状结构,100）C: solid nest.（实性细胞结构, 100）AAeEeEFig 2.The expression of AFP in YSTA:loose reticular network

25、(网状结构,100）DD图1儿童YST常规组织病理学图片(HE，100)B: papillary patterns.（乳头状结构, 100）D: glandular patterns（腺样结构, 100）BB图2 AFP 在YST中的表达 （IHC，100）B:glandular patterns（腺样结构，100）AACCFig 3 .The expression of SALL4 in YSTA:loose reticular network(网状结构, 100）C:solid nest .（实性细胞结构, 100）图4. SALL4在MT中的表达（SALL4100）BBDD图3. YST

26、中SALL4 的表达（IHC，100） B:papillary patterns.（乳头状结构, 100）D:glandular patterns（腺样结构, 100）图5. SALL4 在儿童TLCT的表达（SALL4100）AABBCCFig 6 .The expression of GPC3 inA:loose reticular network(网状结构, 100）C:loose reticular network(网状结构, 200）图7. GPC3在儿童TLCT的表达（GPC3100）DD图6. GPC3 在YST 中的表达B:glandular patterns（腺样结构, 10

27、0）D:glandular patterns（腺样结构, 200）图8.GPC3在儿童MT中的表达（GPC3100）AA图9-A SALL4在YST中的表达（SALL4100）AA图 10-A GPC3在YST中表达（GPC3100）AA图11-A SALL4在YST中的表达（SALL4100）BB图 9-B AFP在YST中的表达（AFP100）BB图 10-B AFP在YST中的表达（AFP100）BB图 11-B GPC3在YST中表达（GPC3100）参考文献1Nogales-Fernandez F,Silverberg SG,Bloustein PA,et al. Yolk sac

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47、lasses of B cell lymphoma. Lab Invest. 2001,81:555-564.31Kohlhase J,Heinrich M,Schubert L,et al. Okihiro syndrome is caused by SALL4 mutations. Hum Mol Genet. 2002,11:2979-2987.32Cao D,Li J,Guo CC,et alSALL4 Is a Novel Diagnostic Marker for Testicular Germ Cell Tumors. Am J Surg Pathol. 2009,33(7):1

48、065-107733Cao D,Humphrey PA,Allan RWSALL4 is a novel sensitive and specific marker for metastmicgerm cell tumors，with particular utility in detection of metastatic yolk sac tumors. Cancer.2009, l15(12):2640-265134Zynger DL,Dimov ND,Luan C,et al. Glypican 3: a novel marker in testicular germ cell tum

49、ors. Am J Surg Pathol. 2006,30:1570-157535Wang SK,Zynger DL,Hes O,et al. Discovery and diagnostic value of a novel oncofetal protein: GPC3. Adv Anat Pathol. 2014,21:450-460附 录1、作者简历： 姓名：武鹏性别：男 籍贯：山西大同出生年月：1987.3 2007年9月2012年7月 山西医科大学就读学士学位 2012年9月至今 温州医科大学攻读小儿外科硕士学位 2、期间所获资格证书/奖励： 2014年12月获得医师资格证书 3

50、、迄今所发表论文： 1.武鹏，陈肖鸣. 异物性肠穿孔9例临床分析. 临床小儿外科杂志. 2014,12(13):537-539. 2. peng Wu,zhaoguang Feng,xiaoming Chen. HYPERLINK /pubmed/25117821 Hyperfibrinogenemia in appendicitis: a new predictor of perforation in children. Pediatr Surg Int.2014 Nov,30(11):1143-1147 4、参加会议 1.2014年10月参加国际转化医学大会 致 谢时光飞逝，日月如梭。转眼

51、之间，三年研究生的学习生涯即将结束。走过现在，回首过往，我激动过，悲伤过，有奋斗，也有挫折。不管咋样，我坚持了下来，最后得到丰硕的回报。研究生三年将是我以后人生道路上最重要的三年，因为在这短暂的时光里，我的人生阅历、科研水平及工作能力都得到了大幅度的提高。这离不开各位老师、同学和家人的悉心支持和鼓励，借此机会对他们表达由衷的谢意。 首先要感谢我的恩师陈肖鸣教授，无论是在科研学习上，抑或在工作上，还是待人接物上，他都为我树立了成功的典范。身正为师，德高为范。在科研上，拥有严谨求实、认真负责的态度；工作中，拥有娴熟的临床基础应变能力，处处体现人文关怀；待人处事上，能已所不欲，勿施于人，能从多方面、

52、多角度的分析和看待问题。再次感谢恩师对我的教诲和指导！感谢李仲荣教授在临床实践和科研工作对我的指导，感谢他在临床实践中对我悉心的教诲及生活上的关心、帮助和支持。 感谢小儿外科的各位老师及师兄们在我临床实践和科研工作过程中对我的细心关心和帮助，为我提供了很多临床实践机会。感谢我们小儿外科的护士们在临床工作中给了我较多的宽容和谅解。 感谢附二病理科华巧巧、周婵萍、周伶俐老师的帮助。感谢温州医科大学公共卫生学院邬红梅老师的悉心帮助与指导。感谢在读的各位师弟们在生活和工作上的支持和帮助。 感谢三年中一直在默默支持我的家人们，感谢他们不辞辛苦，是他们的关爱和帮助激励着我的前行。 再次感谢所有关心、支持和

53、帮助过我的老师、同学及朋友们，对他们表达最真诚的祝福和深深的敬意睾丸生殖细胞肿瘤标志物的最新研究进展睾丸生殖细胞肿瘤(testicular germ cell tumors，TGCTs)是男性最常见的恶性肿瘤之一，好发年龄是20-44岁1。TGCTs是中青年男性实体瘤最常见的死因，在许多西方国家的发病率在逐年上升2。由于睾丸生殖细胞肿瘤好发于青壮年，对社会和患者产生极大的经济负担，有必要引起我们的高度重视。关于睾丸肿瘤的组织来源众说纷纭，最初的假说是在1972年由Skakkebeak证实非典型精原细胞可以发展为睾丸肿瘤。在睾丸肿瘤的发生和发展方面，长期以来一直存在两种不同的观点。传统的观点认为

54、精原细胞瘤和胚胎癌、畸胎瘤经由两种不同的途径形成，但随着近年来越来越多的相关研究，更多的学者认为精原细胞瘤有可能是所有生殖细胞肿瘤共有的前身病变3。根据睾丸肿瘤的组织来源，结合生物学和组织学特性，将其分为生殖细胞和性腺基质肿瘤。生殖细胞肿瘤由生殖细胞或者胚胎干细胞发展而成，绝大多数发生在性腺（睾丸和卵巢），少于10%的睾丸肿瘤发生在性腺外的纵膈和颅内等部位。生殖细胞肿瘤包括卵黄囊瘤、畸胎瘤、表皮样囊肿、精原细胞瘤、绒毛膜癌、胚胎癌，其中表皮样囊肿被认为是单层的畸胎瘤 4。基于睾丸的生物学特性，也常常将其分为良性和恶性。睾丸生殖细胞肿瘤约占所有原发性睾丸恶性肿瘤的90%5，其中睾丸精原细胞瘤占有

55、的比例约为40%。睾丸生殖细胞肿瘤来源之一的假说是生殖细胞与体细胞的细胞分裂方式不同，配子充当了遗传信息交换和转移的载体。生殖细胞需要不同于体细胞的调控方式和DNA修复方式，而且调控基因表达的方式也略有不同。生殖细胞在发育过程中，仍保留很好的胚胎干细胞能力，因此生殖细胞和生殖系统在微观和宏观环境发生变化的时候，也会发生敏感的相应变化。因而当环境和生活方式发生改变时，男性生殖系统也会紊乱，进而引起肿瘤的发生。结合流行病学、临床表现、表型特点、染色体组成及基因组印迹，WHO把TGCTs分成3组，共计5种类型，即婴儿青春期前睾丸生殖细胞肿瘤(畸胎瘤和卵黄囊瘤)、青春期后和青年男性睾丸生殖细胞肿瘤(精

56、原细胞瘤和非精原细胞瘤)和老年男性的精母细胞精原细胞瘤；其中非精原细胞瘤又包括胚胎癌、卵黄囊瘤、绒毛膜上皮癌和畸胎瘤。不同类型的睾丸生殖细胞肿瘤的治疗方案不同6，例如精原细胞瘤一般对放疗敏感，治疗方案首选低剂量放疗，而非精原细胞瘤的生殖细胞肿瘤一般不选择放疗方案。TGCTs的诊断基于HE染色，但是将近50%的生殖细胞肿瘤为混合型，而且不同类型的生殖细胞肿瘤可能会有重复的组织学特性，极易与睾丸非生殖细胞肿瘤相混淆。而且在临床上往往有30%的诊断为非精原细胞瘤的睾丸生殖细胞肿瘤病人，预后随访中并没有得到预期的效果，而且在精原细胞瘤的治疗中，很多病人出现了对化疗药物的耐受，治疗效果不是很好。当面对这

57、些复杂的病患时，灵敏性和特异性较高的肿瘤标记物在诊断方面就发挥了不可或缺的作用，准确的诊断睾丸生殖细胞肿瘤，进而确定其分型，选择合适的治疗方案，就显得尤为关键。鉴于睾丸生殖细胞肿瘤的分型与诊断和预后密切相关，灵敏而特异的肿瘤标记物就成为了研究的一种必然趋势，近些年来，除了一些常规的睾丸生殖细胞肿瘤标记物以外，出现了诸如OCT3/4、NANOG、SALL4、GPC3、Lin28、TRA-1-60、PTN和FGF-2、循环肿瘤细胞、HMGA1、HMGA2、Aurora B、 PATZ1、miRNA等新型肿瘤标记物。下面对上述睾丸生殖细胞肿瘤标记物一一阐述。1. AFP、HCG、LDHAFP、HCG

58、、 LDH是睾丸生殖细胞肿瘤目前最常用的三种血清标记物，主要应用于睾丸生殖细胞肿瘤的预后和随访7。AFP也叫甲胎蛋白，是一种由胎儿卵黄囊和肝脏产生的膜表面蛋白。胎儿血清中AFP水平在怀孕的前三个月逐渐上升，然后开始下降。出生后的婴儿血清中仍有较高水平的AFP,一般在第二年开始下降。AFP主要用来监测非精原细胞瘤型的睾丸生殖细胞肿瘤7。HCG是人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, HCG）,主要应用于产生HCG的睾丸生殖细胞肿瘤的诊断和随访，术后HCG水平的升高提示肿瘤残余；放疗后血清中HCG水平的升高，提示睾丸生殖细胞肿瘤复发的可能。在睾丸生殖细胞肿瘤

59、的病理诊断中，AFP常用在睾丸胚胎癌与睾丸卵黄囊瘤的鉴别上。胚胎癌同样起源于生殖细胞，但是具有向胚外和胚内组织分化的倾向，仅仅从病理形态学方面很难与卵黄囊瘤鉴别；若通过免疫组织化学方法联合检测组织标本中AFP、HCG的表达，据AFP阳性、HCG阴性可判断为卵黄囊瘤，而AFP阴性、HCG阳性则为胚胎癌。尽管有研究证实LDH(乳酸脱氢酶lactate dehydrogenase)在诊断睾丸生殖细胞肿瘤方面相当有价值，但并不具有特异性。LDH在所有的染色体异常的睾丸生殖细胞肿瘤中均有表达，主要体现在染色体12P片段的高拷贝量。相比较而言，AFP和HCG在非精原细胞瘤的睾丸生殖细胞肿瘤的诊断中更有价值

60、，而且可以提示肿瘤组织的分化。2.PLAP称作胎盘碱性磷酸酶(placental alkaline phosphate,PLAP)，是一种膜表面蛋白，属于碱性磷酸酶(LAP)同工酶的一种，主要由妊娠后期女性的胎盘滋养叶细胞合成。研究证实，生殖细胞来源的肿瘤组织中PLAP含量增高。1968年Fisherman首次发现PLAP可以作为里根Regan同工酶来监测肺癌8,随后Beckstead首次检测到睾丸原位癌可以表达PLAP。Wahren首次发现PLAP水平在精原细胞瘤患者上显著升高，后续大量的实验数据业已证实，PLAP水平的升高与精原细胞瘤的发生密切相关，从而这一指标被广泛用作精原细胞瘤的诊断监