变更场地的可比性研究-以注射用重组人生长激素为例

1、概述重组人生长激素的发展历史人生长激素（hGH）是由脑垂体前叶，含有嗜酸性颗粒的生长激素（GH）分泌细胞所分泌，为191个氨基酸构成的肽类激素。正常情况下，生长激素hGH呈脉冲式分泌，生长激素（HGH）的分泌受 HYPERLINK /view/110042.htm t _blank 下丘脑产生的生长激素释放素(GHRH)的调节，还受 HYPERLINK /view/26498.htm t _blank 性别、 HYPERLINK /view/418639.htm t _blank 年龄和 HYPERLINK /view/116121.htm t _blank 昼夜节律的影响， HYPERLIN

2、K /view/48319.htm t _blank 睡眠状态下 HYPERLINK /view/825467.htm t _blank 分泌明显增加。生长激素的主要生理功能是促进 HYPERLINK /view/66841.htm t _blank 神经组织以外的所有其他组织生长；促进 HYPERLINK /view/1051481.htm t _blank 机体合成代谢和蛋白质合成；促进 HYPERLINK /view/16.htm t _blank 脂肪分解；对 HYPERLINK /view/1340.htm t _blank 胰岛素有 HYPERLINK /view/462536.h

3、tm t _blank 拮抗作用；抑制 HYPERLINK /view/16023.htm t _blank 葡萄糖利用而使 HYPERLINK /view/42545.htm t _blank 血糖升高等作用。生长激素主要生理作用是对人体各种组织尤其是 HYPERLINK /view/15472.htm t _blank 蛋白质有促进合成作用，能刺激骨 HYPERLINK /view/205579.htm t _blank 关节软骨和骨骺软骨生长，因而能增高。人体一旦缺乏生长激素就导致生长停滞。1886年Pierre Marie 第一次在临床上观察到脑下垂体的功能，发现在肢端肥大病人中脑下垂

4、体增大。20世纪约翰霍普金斯医院的Harvey Cushing第一次试验发现垂体前叶在人、小鼠和狗中具有促生长作用14。1921年，Evans和Long牛垂体前叶的提取物可以刺激正常大鼠的生长5，很快又发现此提取物可以使去垂体的大鼠保持生长6。促进生长的提取物发现可以刺激合成代谢效应，降低尿中氮、钙和磷的排泄 7,8。尿中这些元素的测定提供了一个简便的生物活性检测方法，并用于在垂体提取物中分离活性组分。1944年Li和Evans第一次从牛垂体中分离现在已知为生长激素的多肽激素9。 由于牛生长激素没有成功的促进人的长高10，因此人们开始从尸体或去除垂体的乳腺按患者的垂体中提取人生长激素11-13

5、。在临床试验中，人和猴子的生长激素产生了合成代谢，并刺激了长高14-15。猿和非猿的生长激素的的生物化学差异被鉴别出来，同时解释了生理效应的物种特异性14。在1957和1985年之间，从尸体垂体提取的人生长激素被用于很多生长激素缺乏儿童的激素替代治疗中16。在此期间，生长激素治疗发现是有效并没有什么副反应。然而，人垂体生长激素是稀缺和昂贵的。其他治疗的应用开发，或人生长激素的细胞作用机理的研究时不可能的。科学的进步改变了人生长激素领域的发展。人生长激素的DNA被克隆到了细菌质粒上17，从此开辟了基因工程人生长激素商业化的道路。1985年被报道18发现儿童期使用人生长激素的儿童，成年后发现罹患致

6、命的神经退行性疾病-克雅病，因此美国食品药品监督管理局（FDA）在上世纪80年代命令停止一切提取自死人脑垂体的hGH，并不准应用于人体上。这一事件促发了重组人生长激素在临床上商业化使用。随着在细菌中大规模生产人生长激素，人生长激素的供应不再成为人体或实验室进行各种治疗研究的限制。20世纪80年代，基因工程兴起。1981年Genentech公司利用大肠杆菌（E. Coli）包涵体技术研制出含192氨基酸的基因重组人生长激素Met-rhGH。与天然hGH相比，在N-末端多了一个蛋氨酸残基，又称为somatrem (Protropin)。随着基因工程技术的发展，1986年通过基因重组技术合成出含天然

7、序列的重组人生长激素。上世纪90年代人们纯化了人生长激素受体蛋白，并克隆了基因19,20。通过X射线晶体衍射解析了人生长激素受体蛋白和人生长激素的相互作用的三维结构21。生长激素受体结构的知识对生长激素信号传导机理的研究提供了新的视野和方向。直接单位点突变技术被用于对生长激素配体-受体相互作用的研究22，分子方法也被用于生长激素受体激动剂的设计。人生长激素基因簇大约有66,500个碱基，位于第17染色体的长臂上23。由GH-N（正常生长激素基因），CS-L（类绒毛膜生长激素），CS-A（绒毛膜生长激素A），GH-V（生长激素变体基因，也是胎盘生长激素）和CS-B（绒毛膜生长激素B）5个基因家族

8、组成。GH-N和GH-V有时也称为GH-1和GH-2。绒毛膜生长激素也是胎盘催乳素基因。这5个基因的DNA序列高度同源。因此猜测生长激素基因家族通过基因复制而产生的。只有GH-N是正常健康必须的。切除或突变GH-N基因引起IA型生长激素缺乏，这是最严重的生长激素缺乏。具有这个缺陷的个体不能产生内源性生长激素。在出生或出生36个月引起有明显的重度低血糖和生长延缓24。这些患者初始对生长激素替代有响应，但治疗1年内由于生长激素抗体产生而抑制了生长。GH-N基因在垂体前叶表达，是在儿童和成年人中循环的主要形式25。生长激素是分泌蛋白，它的合成是一个含26个氨基酸的激素前体。当生长激素跨过内质网膜转运

9、到贮藏粒中时信号肽被切除。GH-N表达的生长激素是一个22kDa，191个氨基酸的单链多肽。生长激素生物活性构象含有两个二硫键桥。22kDa GH-N基因产物在人的肝脏和受体结合，并刺激IGF-1的产生和长高。所有的人生长激素都是采用注射的方式给药。皮下和肌内注射时等价的26。因为有较小的疼痛感，皮下注射更好。腹部的皮下注射比大腿的皮下注射有更高的生长激素血清浓度，然而刺激IGF-1的水平相当27。在循环系统内生长激素和高亲和的生长激素结合蛋白（GHBP）结合，和这个蛋白结合延长了生长激素在循环系统的半衰期。给药的时间不影响血清中生长激素的水平，晚上给药模拟了生理的生长激素峰值28。生长激素的

10、清除半衰期大约在2到3小时之间。通过在肝脏和肾脏的代谢而清除的，成年人比儿童清除速率更快29。人生长激素是非糖基化的，因此目前国际上已经批准上市的重组人生长激素主要是由细菌（E. Coli）生产的，如Genentech的Nutropin，Eli Lilly的Humatrope，Novo Nordisk的Norditrope等。也有用哺乳动物细胞生产的，如Serono的Saizen；以及由酵母生产的，如LG的Valtropin。 REF _Ref354145858 h 表 1列出了目前主要重组人生长激素的生产商和在美国和中国批准上市的时间。我国内已上市产品均是由大肠杆菌（E. Coli）生产的。

11、表 SEQ 表 * ARABIC 1 主要重组人生长激素的生产商生产商商品名美国批准日期中国批准日期美国礼来制药Humatrope1987年3月2009年6月美国基因技术公司 HYPERLINK /scripts/cder/drugsatfda/index.cfm?fuseaction=Search.Set_Current_Drug&ApplNo=019676&DrugName=NUTROPIN&ActiveIngred=SOMATROPIN%20%5BrDNA%20origin%5D&SponsorApplicant=GENENTECH&ProductMktStatus=1 Nutropin

12、1993年11月/辉瑞制药Genotropin1995年8月2009年7月默克雪兰诺Saizen1996年10月2008年4月 HYPERLINK / t _blank 诺和诺德制药有限公司 HYPERLINK /scripts/cder/drugsatfda/index.cfm?fuseaction=Search.Overview&DrugName=NORDITROPIN Norditropin Flexpro2000年6月2008年6月 HYPERLINK /WS01/CL0860/56293.html t _blank 山德士制药有限公司 HYPERLINK /scripts/cder/

13、drugsatfda/index.cfm?fuseaction=Search.Overview&DrugName=OMNITROPE Omnitrope2006年5月/上海联合赛生物工程有限公司珍怡/1999年7月 HYPERLINK /list/co,c,2046275,000000,10,1.html t _blank 长春金赛药业有限责任公司赛增/1998年 HYPERLINK / t _blank 安徽安科生物工程股份有限公司安苏萌/1999年*met-hGH已下市重组人生长激素在大肠杆菌中的表达有两种形式，第一种形式是甲硫氨酸生长激素m-hGH，他和天然生长激素有一个氨基酸的差异，在

14、N端多了一个甲硫氨酸，美国基因技术公司和诺和诺德最初的产品就是m-hGH，目前这种形式的重组人生长激素已经下市。第二种形式是真实的人生长激素。一些研究表明甲硫氨酸生长激素比真实的人生长激素产生较高的抗体30，美国礼来公司的Humatrope是第一个批准的和天然序列一致的重组人生长激素31。甲硫氨酸残基和细菌蛋白结合的痕量的人生长激素比单纯的甲硫氨酸人生长激素产生更高的免疫原性，这个问题可以通过纯化而缓解。抗体的产生很少干扰人生长激素的生物活性，因为抗体的亲和性和浓度均较低31。生长激素抗体水平使得市场不再追随甲硫氨酸人生长激素。哺乳动物细胞的人生长激素有非常低的免疫原性32。目前主要的重组人生

15、长激素的生产商均提供的是和天然人生长激素一致的重组人生长激素。大多数生产商采用的是大肠杆菌系统，因为目前批准上市的产品证明大肠杆菌系统表达的人生长激素的免疫原性并未对产品的有效性和安全性产生不利的影响采用大肠杆菌系统是最经济的，而且大肠杆菌系统已经是比较成熟的基因工程技术，上游构建和下游纯化均有比较成熟的技术，工艺控制比较稳定。重组人生长激素是一个单链多肽激素，通常以生物活性的单体存在，但正像大家所知的他易聚集为二聚体，并在热和机械应力下（如制备过程中的摇动等）转化为多聚体而失去活性。生长激素的药物配方趋向于不稳定，尤其在溶液中，生长激素容易生成降解产物，如脱氨和氧化产物。主要的降解反应是1）

16、直接水解脱氨或通过环状琥珀酰亚胺中间体而形成L-asp-hGH，L-iso-asp-hGH， D-asp-hGH以及D-iso-asp-hGH；2）在14和125位上甲硫氨酸残基的氧化；3）聚集；4）肽骨架的截断。冻干状态以及溶液状态的生长激素的主要降解产物是脱氨组分。脱氨发生在149的Asn天冬酰胺上，在152的天冬酰胺残基上也会产生少量的脱氨。在溶液中人生长激素在14和125位上的甲硫氨酸极易氧化。溶液中hGH氧化形成亚砜主要原因是配方中的溶解氧。蒸馏水中氧气的溶解度大约是200uM，而对于4IU/ml的生长激素来说，其浓度相当于60nM。在正常的储存条件下，溶解氧的量超过了3000倍生长

17、激素的化学计量，所以是不能通过塞盖或包装前对缓冲溶液除气来解决溶解氧的问题。很多降解反应多可以通过冻干从蛋白质中移走水分而显著降低，所以现在生长激素通常都是冻干的，在4以冻干形式储存的冻干剂型，使用前再重新溶解，大部分的商品重组人生长激素是冻干形式的。除了常见的冻干形式制剂外，考虑到使用方便和患者的依从性，人生长激素的溶液制剂和缓释制剂的研究也很多。目前国际上诺和诺德和美国基因技术公司均有溶液剂型的生长激素上市，但由于人生长激素在溶液中很不稳定，因此货架期要比冻干剂型短很多，而且对运输的要求也比较高，溶液剂型对温度的敏感性比冻干剂型高很多。从二十世纪八九十年代至今，普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻

18、和干燥都会引起蛋白质的变性。Dean33认为在冷冻过程中缺少保护剂的情况下，蛋白质将失去活性；而脱水过程本身能使蛋白质损伤，从而复水后蛋白失去活性。保护剂的作用一般认为是通过与蛋白的氢键作用而保护了蛋白由于失去水分而裸露的基团。保护剂的浓度和冻干速率相关，由于对于药物制剂来说保护剂的浓度不能过高，所以要有较大的冻干速率。人生长激素制剂的稳定性是和水分以及氧有密切的关系，在低的水分含量以及最小氧的存在下制剂的稳定性最好34。但是在不加保护剂的情况下，如果单纯降低水分含量可能适得其反，因为蛋白如果失去最后一层水分的保护，将因为基团的暴露而聚集变性。有报道35人生长激素在含水量4.6%时完全变性，而

19、在含水量7.6%时没有变性。所以冻干过程应该加入合适的保护剂以及其他辅料，并且含水量不是越低越好。较少氧对蛋白的氧化，可以通过充氮气来保护36。冷冻干燥过程中的降温速率的选择与保护剂的浓度有关，如果保护剂浓度很高，以不太大的降温速率就能使溶液以玻璃态固化。很多人认为快速冷冻有益于生物活性，因为快速冷冻可以减少缓冲液结晶引起的pH变化，减低蛋白质局部高离子强度的接触时间，减少变性可能发生的时间。但是很多证据表明冻融和冷冻干燥后，快速冷冻对蛋白的活性回收不利，并对贮藏期冻干产品的稳定性也有影响37。用磷酸缓冲液和甘露醇作为赋形剂体系，在pH7.47.8时，冷冻速率对人生长激素的可溶性聚合物形成的影

20、响检测不到，可是对不溶性聚合物形成的影响是显著的，冷冻速率越高聚合物越多。不溶性聚合物的形成被冷冻前的低pH加速。冻干溶液的pH很重要，对脱氨的影响较大。选用不同的缓冲溶液对pH的要求也不一样。当选用磷酸盐作为缓冲液时，在较低的pH（6.0）下，有较少的脱氨组分，但在此pH下较易产生聚集38。人生长激素溶液剂型就是选用较低的pH，添加非离子表面活性剂防止聚集。人生长激素最常用的冻干保护剂是甘氨酸和甘露醇。两种配方比很重要，根据剂量的不同两种物质加入的比例是不同一样的。甘露醇作为保护剂和甘氨酸一起起到稳定冻干制剂的作用。为了保证重新溶解后人生长激素的稳定，也有在溶解水中加入非离子表面活性剂来增加

21、溶液的物理稳定性，如诺和诺德的NorditropinSimpleXx，在溶解水中加入泊洛沙姆188以增加物理稳定性。表2列出了价格典型的商品化重组人生长激素的配方。表 SEQ 表 * ARABIC 2常见商品化重组人生长激素的冻干配方*商品名剂型规格赋形剂缓冲盐rhGH甘氨酸甘露醇蔗糖NaH2PO4Na2HPO4pHGenotropin冻干剂型4.5IU1.527.60/0.300.306.71.8/0.320.326.7Humatrope155525/01.137.5186618/01.367.5Nutropin1551.745/0.451.37.4Saizen155/34.26.5-8.5

22、*来源于FDA网站相关产品的说明书 REF _Ref354161124 h 表 2中可以看到大多数上市产品采用的甘氨酸和甘露醇配方系统。本文讨论的产品就是采用冷冻干燥技术制备的冻干粉针剂型，也采用和上市产品同样的甘氨酸和甘露醇体系，配方均得到批准，长期稳定性研究发现，冻干剂型和溶液剂型相比较在货架期要稳定的很多，这也是目前市场上还是主要以冻干剂型为主的原因。场地变更的原因注射用重组人生长激素是上海联合赛生物工程有限公司已上市十多年的老产品，随着市场的扩大，原生产车间已不能满足市场需求，为此在原址上新建了注射用重组人生长激素生产车间，用于注射用重组人生长激素的生产。由于在原址上新建，原质量检测、

23、原辅材料采购和储存，以及质量保证系统均采用原来的系统，检测、原辅材料和质量保证系统的风险较低。本次是在原厂址增建了一个注射用重组人生长激素的生产线，包括了原液生产车间和制剂生产车间，对于本次新建车间经历了下面几个阶段。表SEQ 表 * ARABIC3新增车间经历的阶段流程阶段要求设计前根据历史研究和生产数据分析和评估原液和制剂的关键工艺参数，并分析其对终产品质量属性的影响。厂房设计根据关键工艺参数的分析结果，提出对厂房和设备的工艺设计要求。厂房和设备应可以满足有效控制关键工艺参数的要求。安装确认完成厂房和设备3Q试制在新建车间进行试制，考察车间、设备、人员等是否可以按照预定的工艺参数进行生产，

24、并得到合格的产品。工艺验证根据是试制的结果完善工艺规程和批记录等，然后进行工艺验证。比较研究新车间和老车间的原液和成品进行全面的药学比较研究。持续改进新老车间进行持续的考察和比较，对更多批次的原液和成品进行回顾性的验证，进一步确认工艺的稳定性。在新车间的设计前根据实际需要，放大了发酵规模和冻干规模，保持其他操作单元规模不变。对于生物制品，其生产工艺是关键的，因此在整个新车间发展阶段，以不改变关键工艺参数和关键质量属性为前提进行设计、实施和验证。注射用重组人生长激素工艺流程注射用重组人生长激素是冻干粉针剂型，其原液通过基因工程技术将目的基因插入载体质粒中，然后将质粒转化到大肠杆菌而得到可以表达重

25、组人生长激素的大肠杆菌工程菌，再通过大肠杆菌的培养使之生产目的蛋白重组人生长激素。由于重组人生长激素是通过大肠杆菌来生产的，因此需要将目的产物和大肠杆菌其他组分如宿主蛋白等进行分离。培养后的大肠杆菌需要通过一系列的工艺步骤进行分离纯化后才能得到纯净的重组人生长激素原液。得到的原液经过配制、除菌过滤、冻干和包装等制剂过程，得到终产品注射用重组人生长激素冻干粉针。对于药品的生产，图1形象的给出了关键物料属性和关键工艺参数对关键质量属性的影响。根据这一定义，工艺状态取决于该工艺的关键工艺参数和输出物料的关键物料属性39。药品生产单元操作药品生产单元操作CMAs输入物料CQAs产出物CPPs关键工艺参

26、数图 SEQ 图 * ARABIC 1关键物料属性（CMAs）和关键工艺参数（CPPs）对关键质量属性（CQAs）的影响生物制品由于分子量大，结构复杂，对于分析方法和仪器设备要求颇高；尽管如此，现代分析技术难以按照个体分子的2级及3级结构进行完整表征化测定，因此主要通过控制其生产工艺来说明批次生产的相似性；而生产工艺是通过多个生产单元操作来实现的。注射用重组人生长激素的生产工艺也被分为多个单元操作， REF _Ref353921443 h 图 2给出了注射用重组人生长激素生产工艺流程图。流程图中根据 REF _Ref353921457 h 图1的方法，给出了每个单元操作的输入物料和产出物。从图

27、中可以看出，上一步骤的产出物是下一步骤的输入物料，这里将工艺的产出物除原液、半成品和成品外的工艺产出物均定义为中间品。根据多年的生产经验对每一个单元操作的物料属性和工艺参数进行分析，并评估其对关键质量属性的影响。当输入物料的某个质量属性（如水分、纯度）的变化能显著影响产出物的属性时，则定义其为关键物料属性。当工艺参数运行参数（如流速、转速）或工艺状态变量（如温度、压力、pH）的实际变化能显著影响产出物料的属性时，则定义该工艺参数是关键的40。新建车间输入物料和产出物的关键属性CMAs和CQA应和老车间保持一致。细胞库（细胞库（MCB和WCB） 培养基、工艺空气、纯化水 发酵培养中间品1离心捕获

28、菌体中间品1 中间品2初纯中间品2 各种盐、纯化水 中间品3精纯重组人生长激素原液中间品3 层析介质、过滤膜、注射用水 配制中间品4重组人生长激素原液 辅料、注射用水 除菌过滤半成品中间品4 过滤膜、工艺空气、注射用水 灌装中间品5半成品 胶塞、西林瓶、注射用水 冻干中间品6中间品5 氮气 钆盖成品冻干品 铝盖 包装包装成品成品 瓶贴、说明书、外包装 输入物料产出物生产操作单元图 SEQ 图 * ARABIC 2 注射用重组人生长激素工艺流程图（下划线表示单元操作的产出物）从总体的工艺流程上看原液是成品关键物料，新车间原液的关键质量属性和老车间不应有显著差异，原液后面工艺的变更不对原液的质量属

29、性产生不利的影响。研究目的与意义根据关于贯彻实施的通知（国食药监安2011101号）和关于进一步明确眼用制剂等产品实施新修订药品GMP期限的通知（国食药监安2012106号）要求，涉及无菌检查项目制剂和原料药均应在2013年12月31日前达到新修订的药品GMP要求。其他应在2015年12月31日前达到新修订药品GMP要求。生物制品均应在2013年12月31日前达到新修订的药品GMP要求。药品生产质量管理规范（2010年修订）（简称新版GMP）41是一次重大的GMP修订，特别是针对无菌药品的生产提高了要求，很多生产商为符合新版GMP要求必须对原有厂房进行改建，与此同时很多生物制品通过改建或扩建淘

30、汰老的工艺，采用新工艺。如何将变更后的产品与变更前的产品进行对比是很多生产商面临的问题。生产方法、工艺、质控检测方法以及产品表征检测方法的改进，使生产商能够较好对变更对生产工艺和生产设施的影响进行识别和评估，这使得从药学上证明其有可比性成为可能。比如，近年来大分子分离技术、产品以及工艺相关技术大大改进，生产商在建立产品和生物活性表征方面经验证的灵敏方法以及对这些检测中差异显著性评价方面所具有的能力，有能力在不必重复进行临床药效研究的情况下，对产品可比性研究进行评价。如果可比性试验证明生产变更并未对产品的安全性、特性、纯度和效价产生影响，可认为这两种产品具有可比性。可比性研究是厂房变更的关键，本

31、文尝试以注射用重组人生长激素新建厂房的可比性研究为例，对如何评价产品变更前后的可比性进行探讨。注射用重组人生长激素产品介绍药品的安全性和有效性是通过上市前非临床和临床试验而评价，药品的关键质量属性通过临床期间的药学研究而最终确定的，因此对于已上市产品的变更，其关键质量属性不应发生变更，否则需要追加非临床或临床试验来确认其安全性和有效性。注射用重组人生长激素产品已上市10多年，欧洲药典、美国药典和中国药典均收录了此产品，具有比较成熟的分析方法，质量标准也是基于对产品和工艺的了解而建立的，因此质量标准反映了其关键质量属性。下面从原液、半成品和成品3个方面分别介绍新车间产品的研究方法和质量标准。原液

32、的研究方法和质量标准重组人生长激素的关键质量属性包括一级、二级和三级结构、理化性质、免疫化学性质、生物活性、纯度和杂质以及产品的稳定性，原液的研究方法应包含上述内容。重组人生长激素的结构 REF _Ref353918240 h 图 3给出了人生长激素的一级氨基酸序列和二硫键位置。图 SEQ 图 * ARABIC 3人生长激素一级结构图42重组人生长激素的分子式为C990H1528N262O300S7，分子量22125道尔顿。其他结构信息列于 REF _Ref353935249 h 表4中。新车间重组人生长激素原液应进行结构的确证，证明其和天然的人生长激素的结构具有一致的一级和二级结构。结构确证

33、检测包括：肽图质谱覆盖率、质谱分子量、N末端和C末端序列检测、二硫键配对检测和圆二色谱法检测。两个车间各取13批原液进行结构检测， REF _Ref353935249 h 表4列出了检测项目和两个车间原液结构的一致性评价标准。表 SEQ 表 * ARABIC 4人生长激素结构确证研究内容检测项目理论值一致性标准质谱分子量22,125Dalton3批原液检测，分子量和理论值误差小于1%；和对照品平均分子量相差小于20Dalton肽图质谱覆盖率氨基酸序列两种酶酶切，分子量覆盖率应大于90%圆二色谱法alfa螺旋占多数相同条件检测，应和对照品谱图一致二硫键配对两对二硫键：Cys53-Cys165和C

34、ys182-Cys189仅有C53-C165和C182和C189两对分子内二硫键，没有错配和分子间二硫键N末端序列NH2-FPTIPLSRLFN末端10个残基序列为NH2-FPTIPLSRLFC末端序列SVEGSCGF-COOHC末端8个残基序列为SVEGSCGF-COOH放行标准注射用重组人生长激素产品已上市10多年，并且是在中华人民共和国药典中有收录，因此质量标准反映了其关键质量属性，下面从原液、半成品和成品3个方面分别介绍新车间产品的研究方法和质量标准。原液的研究方法和质量标准重组人生长激素的关键质量属性包括一级、二级和三级结构、理化性质、免疫化学性质、生物活性、纯度和杂质，以及产品的稳

35、定性，因此原液的研究方法应从上述方面进行。重组人生长激素的结构 REF _Ref353918240 h 图 3给出了人生长激素的一级氨基酸序列和二硫键位置。图 SEQ 图 * ARABIC 4人生长激素一级结构图重组人生长激素的分子式为C990H1528N262O300S7，分子量22125道尔顿。其他结构信息列于 REF _Ref353935249 h 表4中。新车间重组人生长激素原液，应进行结构的确证，证明其和天然的人生长激素的结构具有一致的一级和二级结构。两个车间各取13批原液进行结构检测，检测包括：肽图质谱覆盖率、质谱分子量、N末端和C末端序列检测、二硫键配对检测和圆二色谱法检测。 R

36、EF _Ref353935249 h 表4列出了这些检测的理论值和两个车间原液结构的一致性评价标准。表 SEQ 表 * ARABIC 5人生长激素结构确证研究内容检测项目理论值一致性标准质谱分子量22,125Dalton3批原液检测，分子量和理论值误差小于1%；和对照品平均分子量相差小于20Dalton肽图质谱覆盖率氨基酸序列两种酶酶切，分子量覆盖率应大于90%圆二色谱法alfa螺旋占多数相同条件检测，应和对照品谱图一致二硫键配对两对二硫键：Cys53-Cys165和Cys182-Cys189仅有C53-C165和C182和C189两对分子内二硫键，没有错配和分子间二硫键N末端序列NH2-FP

37、TIPLSRLFN末端10个残基序列为NH2-FPTIPLSRLFC末端序列SVEGSCGF-COOHC末端8个残基序列为SVEGSCGF-COOH放行标准新车间重组人生长激素原液不仅应符合放行检验标准，还应基于收集的历史数据，通过统计学方法建立两个车间比较的验收标准。根据分析方法的性质，可以将放行标准分为定量标准和定性标准，定性标准作为定量标准的补充，更全面的展现产品杂质增减情况。重组人生长激素主要相关杂质有：脱氨组分、氧化组分、多聚体、工艺中被截断的人生长激素片段。主要工艺杂质有：内毒素、宿主菌体蛋白、外源DNA、微生物。内控放行标准的检测方法涵盖了上述杂质的分析。因此可以通过对放行检测结

38、果的比较，证明厂房的变更对原液的理化性质、纯度和杂质是否产生了不利影响。新车间采用至少10批次原液和老车间进行比较，原液应符合放行标准，同时对定量检测数据的统计分析，比较两个车间的平均值和标准偏差，判断两者是否有显著差异。 REF _Ref353931977 h 表 6列出了主要的放行标准检测项目，检测方法基本是药典方法，分析方法可靠并均经过验证。表 SEQ 表 * ARABIC 6 重组人生长激素原液的放行标准检测项目分析方法外观目检鉴别方法（1）中华人民共和国药典二部重组人生长激素项下的鉴别（1）项方法（反相色谱法）方法（2）中华人民共和国药典二部重组人生长激素项下的鉴别（4）项方法（等电

39、聚焦电泳IEF）检查相关蛋白中华人民共和国药典二部注射用重组人生长激素项下的相关蛋白检测方法（反相色谱法）高分子蛋白中华人民共和国药典二部注射用重组人生长激素项下的高分子蛋白检测方法（分子排阻色潽法）电荷异构体等电聚焦电泳细菌内毒素中华人民共和国药典二部附录XI E残余宿主蛋白中华人民共和国药典二部重组人生长激素项下的菌体蛋白残余量检测方法DNA残留中华人民共和国药典二部重组人生长激素项下的外源性DNA残留量下的方法含量中华人民共和国药典二部注射用重组人生长激素项下方法生物学活性中华人民共和国药典二部附录XII P生长激素生物测定法是采用去垂体大鼠体重法和胫骨法进行的生物活性测定法，和生长激素

40、的体内药效学研究采用相同的方法，因此去垂体大鼠体重法和胫骨法测定结果也反映了动物体内药效结果。中华人民共和国药典二部重组人生长激素各论中规定生物活性：照生长激素生物测定法（附录XII P）依法检查，每1mg蛋白中含生长激素不得少于2.5单位（每年至少测定一次）。两个车间各取13批同时进行重组人生长激素体内生物学活性的检验，两个车间原液的生物活性应符合中华人民共和国药典重组人生长激素各论中的规定，两者的活性平均值和标准偏差应没有显著差异，以此证明厂房的变更未改变其体内生物学活性。免疫化学性质免疫化学性质的检测可以采用免疫斑点法或western blot方法，两种方法均针对重组人生长激素的抗原特性

41、进行检测。免疫化学性质的研究，可以证明两个车间生产的原液抗原特异性一致性，它的一致性可以进一步说明两者结构的一致。强制降解试验和长期稳定性新车间生产的原液可以通过高温和光照强制破坏试验，检测相关蛋白、高分子蛋白质、电荷异构体、含量，比较两者之间降解物和降解速率。在工艺不变的情况下降解产物类型和降解速率应该没有显著变化，新车间原液和老车间强制降解比较应不得产生新的降解产物。重组人生长激素原液为冷冻保存，因此无需进行加速稳定性考察，仅进行长期稳定性考察。将新车间和老车间的长期稳定性历史数据进行统计分析和比较，降解速率和杂质类别上应没有明显的差异。重组人生长激素原液长期稳定性考察方法如下：拟考察点为

42、0、3、6、12、18、24、36个月。原液包装形式和老车间一致，贮存温度28。按照中国药典2010年版附录XIX C“原料药与药物制剂稳定性试验指导原则”，本品为注射剂，指导原则规定的重点考察项目为：外观色泽、含量、pH值、可见异物、有关物质。因此重点考察项目为：性状、含量、pH值、可见异物、有关物质（相关蛋白、高分子蛋白）、水分指标。在0、24和36个月进行全项检测。半成品的研究方法和质量标准重组人生长激素原液和辅料按照处方比例进行混合后除菌过滤得到半成品。半成品的放行标准包括：内毒素、无菌、蛋白含量。新车间半成品应符合放行标准，和历史数据比较没有显著差异。半成品除放行标准的检测还应增加稳

43、定性考察，在室温下，考察0、8、16和24小时半成品相关蛋白、高分子蛋白和含量，新车间半成品在考察期内应符合成品的放行标准，比较两个车间上述指标平均值和相对标准偏差，两个车间应无显著差异。成品的研究方法和质量标准注射用重组人生长激素已经被录入中华人民共和国药典，因此其放行标准是不低于中华人民共和国药典2010年版的各论的要求，放行检测涵盖了注射用重组人生长激素理化性质、纯度和杂质、生物学活性等产品关键质量属性。可以作为评价两个车间产品质量的比较标准。新车间注射用重组人生长激素的研究，不仅要求符合放行标准，还应进行生物活性和稳定性考察。新车间至少3个连续批和老车间进行比较，比较方法如下：半成品和

44、成品放行检测中的定量项目应采用统计分析的方法和老车间的历史数据比较，比较平均值，相对标准偏差。两个车间同期生产的产品均应符合质量标准。对两个车间同期生产的产品杂质进行分析，应没有新增杂质的出现。两个车间的产品同时进行高温和光照的强制降解试验，比较两个车间产品在高温和光照情况下降解速率是否有不同，杂质类型是否有差异。新车间连续3批产品进行加速稳定性考察，采用市售小包装贮存，温度252，湿度60%5%。参照中国药典2005年版附录XIX C原料药与药物制剂稳定性试验指导原则以及化学药物稳定性研究技术指导原则设置考察时间点，考察点为0、1、3、4.5和6个月。重点考察项目为：性状、含量、pH值、可见

45、异物和有关物质（相关蛋白和高分子蛋白）。0和6个月进行全项检测。新车间和老车间产品的历史数据进行比较，两者在降解速率和杂质类别上应没有明显的差异。新车间每个规格至少3批进行长期稳定性考察，采用市售小包装贮存，贮存温度53。按照中国药典2005年版附录XIX C原料药与药物制剂稳定性试验指导原则以及化学药物稳定性研究技术指导原则设置考察时间点。时间点在第一年一般为每3个月末一次，第二年每6个月末一次，以后每年末一次。即第0、3、6、9、12、18、24、36个月末取样检测考察指标。重点考察项目为：性状、含量、pH值、可见异物和有关物质（相关蛋白和高分子蛋白）。0、24和36个月分别进行全项检测。

46、和老车间同规格产品进行比较，两者在稳定性上应没有明显差异。表 SEQ 表 * ARABIC 7注射用重组人生长激素放行标准检测方法检测项目分析方法外观目检鉴别方法（1）中华人民共和国药典二部重组人生长激素项下的鉴别（1）项方法（反相色谱法）方法（2）中华人民共和国药典二部重组人生长激素项下的鉴别（4）项方法（等电聚焦电泳IEF）检查水分费休氏法容量滴定法相关蛋白中华人民共和国药典二部注射用重组人生长激素项下的相关蛋白检测方法（反相色谱法）高分子蛋白中华人民共和国药典二部注射用重组人生长激素项下的高分子蛋白检测方法（分子排阻色潽法）电荷异构体等电聚焦电泳异常毒性中华人民共和国药典二部附录XI C

47、细菌内毒素中华人民共和国药典二部附录XI E装量差异中华人民共和国药典二部附录I B注射剂无菌中华人民共和国药典二部附录XI H 薄膜过滤法酸碱度中华人民共和国药典二部附录 VI H溶液的澄清度与颜色中华人民共和国药典二部附录IX A第一法和附录IX B可见异物中华人民共和国药典二部附录IX H灯检法不溶性微粒中华人民共和国药典二部附录IX C第一法含量中华人民共和国药典二部注射用重组人生长激素项下方法生物学活性中华人民共和国药典二部重组人生长激素项下方法初步风险评估输入物料的变更分析和风险评估根据 REF _Ref353921443 h 图 2的工艺流程图，首先对注射用重组人生长激素工艺中的

48、输入物料分别进行分析，找出由于厂房变更而引起变化的输入物料，然后针对这些输入物料进行变更的风险识别和评估。 REF _Ref353922859 h 表8将注射用重组人生长激素的全部输入物料列出，并对可能引起变化的物料进行了识别。表SEQ 表 * ARABIC8输入物料的变更分析物料名称是否变更风险分析细胞库（MCB和WCB）否生物制品的起始物料，是关键物料，由于在原址增建车间，因此种子批采用和原车间相同的种子批，需规定采用相同的转运方式。发酵培养基否半合成培养基，是关键物料，来源和质量标准和原车间一致。储存和称量的地址均未变化。各种盐否初纯和精纯使用了各种盐，如作为缓冲剂的磷酸盐等，这些化学物

49、料的来源、质量标准未发生变化，检测、储存和称量地址均无变化。层析介质否层析介质是关键物料，来源和种类对分离影响很大，因此是不能变更的。采用和原车间一致的采购、质控、存储。过滤膜否过滤膜的来源、材质非常重要，不能变更。采用和原车间一致的采购、质控、存储。工艺空气是工艺空气和产品接触的单元操作主要是发酵和除菌过滤。发酵需要通气保持溶氧。过滤是通过气压使半成品滤过除菌过滤膜。工艺空气系统进行了改造，涉及到变更，风险较高需要进行全面验证。纯化水是发酵和初纯采用纯化水，因为大肠杆菌的发酵相对对水的要求没有细胞培养高，同时大肠杆菌本身产生大量的内毒素，因此在工艺的上游采用纯化水。注射用水是注射用水用于精纯

50、、半成品配制、器具的最后清洗等过程。对于原液生产水是控制内毒素的关键因素，制剂的配料等均采用注射用水，因此注射用水十分重要。新建车间水系统进行了改造，涉及到变更，风险较高，需要进行全面验证。辅料否辅料是关键物料，采用和原车间一致的采购、质控、存储，没有变更。包装材料否内包装材料和产品接触，其来源、材质等均是关键属性，新车间采用和原车间一样的采购、质控、存储，没有变更。氮气否在冻干完成后进行充氮气，使瓶内保持少许负压。氮气的来源和质量标准没有变化。重组人生长激素原液否这些均是工艺过程中得到的工艺产出物，虽然工艺是在新车间实施的，但其物料质量标准、储存条件没有发生变更。半成品否中间品16否输入物料

51、的变更分析可以看出，新增车间由于需要新的制水和工艺空气系统，因此水和工艺空气可能发生了变更。制水和工艺空气系统需要在厂房完成后进行全面的验证，以保证符合预定的要求，并和原车间的控制水平一致。 REF _Ref353930914 h 表 9对水和工艺空气的关键质量属性进行了风险评估，以便于判断变更对产品质量是否产生显著的影响。表 SEQ 表 * ARABIC 9 变更物料的风险评估物料名称工艺参数发生频率O*严重程度S*不可检测度D*RPN=O*S*D工艺空气空气压缩机压力24216储罐压力等24216P级过滤器参数26448干燥参数26224Q级过滤器参数26224S级过滤器参数28232纯化

52、水原水来源26224制水工艺28232清洗工艺28240灭菌工艺28240管路和分配系统28240取样点分布28240注射用水制水工艺28232循环保温28232管路和分配系统28240取样点分布28240*发生的频率O：指发生的频率，分1-10级，从几乎不可能发生失效到发生失效几乎无法避免；严重程度S：指对关键质量属性的影响后果的严重程度评价指标，一般分1-10级，从无失效后果到无警告的严重危害后果；不可检测度D：指不可探测的程度，分1-10级，从几乎肯定到几乎不可能检测。从风险评估的结果看，虽然制水和工艺空气系统发生了变更，但由于其关键质量属性均是可测的，根据老车间的日常监控，在符合设计要

53、求的情况下，工艺空气和水的质量发生不符合要求的频率也很低，因此RPN值不高，说明水和工艺空气的变更风险较小，可以通过对制水和工艺空气系统的验证，以及日常监控降低风险。工艺的变更分析和风险评估根据 REF _Ref353921443 h 图 2的工艺流程图对每个单元操作进行分析，找出发生变更的单元操作，然后针对变更的单元操作进行风险识别和评估。 REF _Ref353926256 h 表10对每个单元操作进行了风险分析，并分析其是否发生了变更。表 SEQ 表 * ARABIC 10注射用重组人生长激素工艺单元操作的变更分析操作单元是否发生变更风险分析发酵培养是新车间采用新发酵系统，发酵体积放大了

54、一倍，因此本操作单元风险较高，需要进行风险的识别和评估。捕获菌体否采用和老车间一样的设备和操作条件，通过增加设备进行放大，单元操作没有变更。初纯否采用和老车间一样的操作条件和工艺设备，单元操作没有变更。精纯否采用和老车间一样的操作条件和工艺设备，单元操作没有变更。配制否药品的配方对产品的质量产生重大的影响，同时配方为注册标准，因此为关键工艺参数，变更需重新申报。同比放大体积，配制方法和储存条件没有变更。除菌过滤是变更为两级过滤，增加一个除菌过滤膜。灌装是批量增大使灌装时间延长。冻干否采用和原车间一样的操作条件，单元操作没有变更。钆盖否采用和原车间一样的操作条件，单元操作没有变更。包装否采用和原

55、车间一样的操作条件，单元操作没有变更。从 REF _Ref353926256 h 表10的分析可以看出，新建车间的变更主要发生在发酵培养、除菌过滤和灌装3个单元操作中。 REF _Ref347666455 h 表11针对这三个单元操作的工艺参数进行了风险评估。表 SEQ 表 * ARABIC 11注射用重组人生长激素工艺的风险评估单元操作工艺参数发生频率*严重程度*不可检测度*RPN发酵培养温度28232通气量26224转速26224补料速度26448pH控制26224培养时间26224除菌过滤过滤体积/过滤膜面积26224过滤压力28232完整性测试210240半成品保存时间48264半成品

56、保存温度210240灌装温度28232灌装体积28232灌装速度24216单元操作时间26224*同 REF _Ref353930914 h 表 9的说明根据 REF _Ref347666455 h 表11的风险评估可以看出，虽然发酵培养、除菌过滤和灌装的操作单元发生了变更，通过对其工艺参数的分析可以看出，由于单元操作的关键工艺参数均可测定，并易于控制，发生不符合的频率较低，因此总RPN值没有超过64的，说明变更的风险不大。可以通过工艺验证，证明其工艺的可控性，并证明对产品的质量是否产生显著的影响，并通过中间品或半成品的检测降低其风险。从以上的风险评估看，本次的场地变更虽然物料和单元操作均有变

57、更，但变更对产品质量的潜在影响比较小。生产工艺应进行充分的验证，包含对工艺文件的核查、培训情况的确认、工况系统的确认、工艺设备的确认、生产操作和监控、取样和检验、时限验证、稳定性的考察。在工艺验证通过的前提下，通过产品的日常监测可以降低引起质量不合格的风险。对比研究结果原液的对比研究结果结构确证两个车间各取3批原液进行结构确证。结构确证检测项目新车间老车间N末端测序NH2-FPTIPLSRLFNH2-FPTIPLSRLFC末端测序SVEGSCGF-COOHSVEGSCGF-COOH分子量Dalton22083.922093.4二硫键Cys53-Cys165Cys182-Cys189Cys53-

58、Cys165Cys182-Cys189肽图质谱覆盖率100%100%圆二色谱法与对照品一致与对照品一致消光系数，M-1 cm-116,86317,070氨基酸组成与理论一致与理论一致结构确证说明变更场地生产的重组人生长激素的结构是正确的，和原车间的产品一致。生物学活性采用去垂体大鼠体重法和胫骨法测定生长激素生物学活性，分别检测连续3批原液的比活，新车间平均比活为3.1IU/mg，原车间平均比活为3.0IU/mg。均符合中华人民共和国药典二部的规定，两个车间的原液生物活性一致。表 SEQ 表 * ARABIC 12 两个车间生物活性的比较车间新车间老车间批次123123生物活性（IU/mg）3.

59、053.143.092.983.103.04平均值3.13.0免疫化学性质采用免疫斑点试验对重组人生长激素的抗原特异性进行检测。检测均呈现阳性。表 SEQ 表 * ARABIC 13 两个车间免疫斑点检测结果对比新车间原车间批次免疫斑点结果批次免疫斑点结果1阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色1阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色2阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色2阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色3阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色3阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色4阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色4阳性对照品显色，阴性

60、对照品不显色，供试品显色5阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色5阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色纯度、杂质和污染新车间进行了连续20批原液的放行检验，均符合内控放行标准。将这20批原液的纯度、杂质和污染，和原车间历史数据进行了比较（见 REF _Ref353938427 h 表14）。可以看出两个车间纯度和杂质的均值和SD值一致，说明两个车间的生产对纯度和杂质控制水平是一致的，变更未对原液的质量产生不利的影响。表 SEQ 表 * ARABIC 14原液纯度、杂质和污染的比较结果检测项目新车间老车间均值SD均值SD相关蛋白质2.18%0.67%2.30%0.58%高分子蛋白质