放疗对食管癌患者血清可溶性MICA含量及外周血NK细胞功能的影响

1、放疗对食管癌患者血清可溶性MICA含量及外周血NK细胞功能的影响【摘要】目的讨论经不同剂量高能X线照射后食管癌患者血清可溶性H-I类分子链相关基因A(sIA)含量、自然杀伤细胞(NK细胞)外表NK细胞2族成员D(NKG2D)受体的表达及其杀伤毒性的变化。方法采用ELISA法检测中晚期食管癌患者(n=28)和正常对照(n=21)血清sIA的含量，并动态分析6例食管癌患者经不同剂量高能X线照射后血清sIA含量的变化。采用流式细胞术检测NK细胞NKG2D受体的表达，胞内染色法分析NK细胞杀伤靶细胞功能的变化。结果与正常对照相比，食管癌患者血清sIA含量明显升高，但不同放疗剂量对食管癌患者血清sIA含

2、量无显著影响。食管癌患者外周血阳性表达NKG2D的NK细胞比例与正常对照相比显著降低，同时其细胞毒活性亦明显降低。而且与治疗前相比，4060Gy的放疗剂量时NKG2D阳性的NK细胞数增加，同时其NK细胞毒活性最强。结论放疗对食管癌患者血清sIA含量无明显影响，但适量放疗可使NK细胞毒活性增强。【关键词】食管肿瘤;放射治疗;H-I类分子链相关基因A;自然杀伤细胞Abstrat:bjetiveTinvestigatethevariatinsinthelevelfseruslubleHlassIhain-relatedgeneA(sIA),theexpressinfthesurfaereeptrna

3、turalkillergrup2eberD(NKG2D)nnaturalkiller(NK)ellsandtheyttxiityfperipheralNKellsinesphagealanerpatientsbyirradiatin.ethdsThenentratinfserusIAprtEinfrediuandadvanedesphagealanerpatients(n=28)andnralntrls(n=21)eredeterinedbyELISA,andthevariatinsintheserusIAleveleredynaiallybservedthrughutthetreatenti

4、thdifferentdsesfirradiatinin6esphagealanerpatients.TheNKG2DexpressinnNKellsereeasuredbyflytetry,andtheyttxiityntargetellsasevaluatedbyintraellularstainingithperfrinantibdy.ResultsInntrasttnralntrls,serusIAlevelsignifiantlyinreasedinesphagealanerpatients;hever,irradiatinatdifferentdsesdidntarkedlyaff

5、ettheserusIAlevels.TheperentagefNKG2D-psitiveNKellsandthEIryttxiitysignifiantlydereased.Furtherre,althughthereasnstatistivariatinsinserusIAbefreandafterirradiatin,theperentagefNKellsandtheiryttxiityereenhanedattheirradiatindsef40-60Gysubsequenttthetreatentandeanhile,theNKellyttxiityasatitspeak.nlusi

6、nsIrradiatinhasndireteffetsntheserusIAlevels,hereasirradiatinatadequatedsesillprtetheyttxiityfNKells.Keyrds：esphagealneplass;irradiatin;HlassIhain-relatedgeneA;naturalkillerellsH-I类分子链相关基因A(HlassIhain-relatedgeneA,IA)位于HLA-B位点上游约46kb，其编码分子构造类似HLA-I类分子，但不与2微球蛋白结合，不递呈抗原肽。IA主要表达于绝大多数肿瘤细胞、病毒感染的细胞、受诱导分化药

7、物处理的细胞及射线照射引起DNA损伤的细胞，代表着机体的一种应激反响1。IA通过与NK细胞、D8+T细胞外表的活化性受体NK细胞2族成员D(NKG2D)相结合，激活免疫系统而去除肿瘤及其他基因组损伤的细胞，在抗肿瘤和抗感染中发挥重要作用2。然而研究发现，肿瘤细胞外表的IA分子可受到金属蛋白酶的降解而成为可溶性分子(sIA)，sIA与NKG2D结合后促进了受体的内吞和降解，进而抑制NK细胞的功能3。在前列腺癌4、肠癌5、宫颈癌6及头颈癌7中均显示血清内sIA含量与患者预后呈负相关。另外，我们的前期研究发现，放疗可促进食管癌细胞株EA-109表达IA分子8，但其是否对食管癌患者血清sIA的含量产生

8、影响，目前尚不清楚。研究发现，NKG2D是NK细胞外表重要的活化性受体，其表达量上下可反映NK细胞的活性状态9。在食管癌的放疗过程中，放疗剂量决定其部分肿瘤控制率，但过高剂量的照射往往损伤患者的免疫功能。因此本研究讨论食管癌患者在承受放疗时对血清sIA含量、NKG2D阳性表达的NK细胞比例及NK细胞毒功能的影响，从而深化理解食管癌患者放疗过程中患者体内NK细胞功能的变化，为进一步研究放疗结合免疫增强治疗提供理论根据。1材料和方法1.1试剂和药品ELISA双抗体夹心法检测试剂盒，购自德国IatisBitehnlgies公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，购自深圳晶美公司。淋巴细胞别

9、离液购自上海生物工程公司;小牛血清和胎牛血清为杭州四季青公司产品;RPI-1640培养基为Invitrgen公司产品;青霉素、链霉素、巯基乙醇为上海生物工程公司产品;K562细胞为本室常规保存;FIT-D56单克隆抗体(Ab)、PE-y5-穿孔素Ab、PE-NKG2DAb购自eBisiene公司。1.2分组正常对照组：21例正常人，男12例，女9例，年龄1862岁。搜集血清5l，其中11例同时搜集外周抗凝血5l。食管癌组：28例中晚期食管癌患者(均为食管病灶长度5,未发现其他的转移灶)，男16例，女12例，年龄5178岁。1.3方法1.3.1直线加速器照射食管癌患者所有食管癌患者予以瓦利安直线

10、加速器6VX线进展放疗。放疗后搜集血清5l，中25例同时搜集外周抗凝血5l。另外，6例食管癌患者在治疗前、治疗剂量累计达2030Gy及4060Gy时均搜集血清5l、外周抗凝血5l。1.3.2ELISA法检测血清sIA浓度双抗体夹心法，包被抗体为A1,检测抗体为BA3(针对IA分子的3构造域)，酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠抗体。取标准品、患者血清、正常对照组血清及PBS各100l参加各孔。封盖后37孵育2h;冲洗3次，用试剂稀释液将检测抗体稀释成终浓度为400g/L，各孔参加100l，封盖37孵育2h;冲洗3次，加酶，冲洗3次，加底物，当显色满意后每孔参加终止液(1l/L硫酸)50l终止反响;轻

11、拍使之混匀后立即上机检测，以450n读取光密度值。经标准品曲线拟合后获得每份标本中sIA的含量。1.3.3流式细胞仪检测NKG2D的表达取5l外周抗凝血，Fill常规别离外周血单个核细胞(PB)，分别用PE-NKG2D单抗、PE-y5-D56单抗，FASAria流式细胞仪检测NKG2D阳性表达的NK细胞比例。1.3.4NK细胞毒活性测定当NK细胞杀伤靶细胞时，释放其细胞内的穿孔素，胞内染色法分析穿孔素阳性NK细胞减少的数量(即释放穿孔素的NK细胞)占总NK细胞的比例，可代表NK细胞的杀伤毒性。详细方法为：取外周抗凝血5l，Fill常规别离PB，与对数期K562细胞按101比例375%2孵育2h

12、，参加高尔基体阻断剂brefieldA(BFA,10g/L)，4h后按照eBisiene公司胞内染色法的操作说明标记NK细胞内的穿孔素。1.4统计学处理用Graphpad4.0软件进展数据处理。组间血清sIA含量、NKG2D阳性表达的NK细胞数、NK细胞毒活性的比拟均用团体t检验。食管癌患者不同剂量照射后血清sIA含量的变化用ANVA方差分析和q检验。食管癌患者经不同剂量照射后NKG2D表达率、NK细胞功能的变化采用团体t检验。P0.05认为差异有显著性。2结果2.1食管癌患者血清sIA含量的变化与正常对照组相比，食管癌组血清内sIA含量显著升高(P0.05)。见表1。表12组血清sIA含量的

13、比2.2不同剂量放疗后食管癌患者血清sIA含量的变化我们动态观察了6例患者在治疗前、治疗剂量分别累计到2030Gy和4060Gy时血清sIA含量的变化。结果显示，6例患者于治疗前、2030Gy及4060Gy的治疗剂量时血清内sIA含量无明显变化(P0.05)。见表2。表2不同放疗剂量对食管癌患者血清sIA含量的影响2.3食管癌患者外周血NK细胞NKG2D阳性表达率及NK细胞毒功能的变化利用流式细胞术分析食管癌组和正常对照组外周血NK细胞表达NKG2D的阳性率，结果显示食管癌组NKG2D阳性率显著降低(P0.05)，见表3。同时利用胞内染色法分析NK细胞接触K562细胞时，释放穿孔素的NK细胞比

14、例作为评价NK细胞杀伤毒性，比拟2组NK细胞的杀伤毒性，发现食管癌组NK细胞毒性明显降低(P0.05),见表4。表32组NK细胞NKG2D阳性表达率的比表42组NK细胞杀伤毒性的比拟2.44060Gy的放疗剂量时NKG2D阳性表达率及NK细胞毒功能的变化对6例食管癌患者动态检测其体内NKG2D的表达率及NK细胞毒功能，分别比拟治疗前、2030Gy和4060Gy的治疗剂量时NKG2D阳性表达的NK细胞数，发现4060Gy的治疗剂量时NKG2D表达率最高，与治疗前相比差异有显著性(P0.05)，见图1。与之对应的是，此时NK细胞杀伤毒性亦最高，与治疗前相比明显进步(P0.05)，见图2。转贴于论文

15、联盟.ll.3讨论我们采用回忆性研究的手段，不仅分析中晚期食管癌患者与正常个体血清内sIA含量、NKG2D阳性表达的NK细胞数及NK细胞毒活性，还观察了承受不同放疗剂量治疗后，患者血清内sIA含量的变化、NKG2D的表达及NK细胞功能变化，从而在整体程度研究高能X线照射对患者体内肿瘤抗原表达及免疫功能的影响，为在放射治疗过程中及时监测患者体内肿瘤负荷及评估免疫功能提供理论根据。前期研究说明，sIA下调NK细胞的功能，而且随着多数肿瘤病程的进展，sIA在血清中的含量升高。Grh等3发现sIA能诱导T细胞外表NKG2D的内吞和降解，并发如今胃肠恶性肿瘤患者的血清中含高程度的sIA分子，且浸润至肿瘤

16、部位的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和外周血T淋巴细胞外表NKG2D受体的表达明显低下，从而认为是这些从肿瘤细胞外表释放的sIA分子导致了NKG2D的下调，并进一步严重影响了抗原特异性T细胞的活性10。Salih等11证实白血病患者的瘤细胞亦表达NKG2D受体的配体H-I类分子链相关基因(I)和UL16结合蛋白(ULBP)，且患者血清中亦含有高程度的sIA分子。Dubrvina等5发现结肠癌患者血清中的高程度sIA还可引起细胞毒性受体NKp44的表达下调，影响NK细胞的细胞毒功能。Jinushi等12发现，晚期肝癌患者血清中sIA含量明显高于早期患者。本研究结果显示，食管癌患者与正常人相比，血清

17、sIA含量明显升高，说明sIA同样与食管癌的进程相关。但不同剂量放疗后食管癌患者血清sIA的含量无明显变化，提示放疗虽然可以促进肿瘤细胞上调膜外表IA抗原表达，却对IA自肿瘤细胞外表脱落无重要影响。IA与NKG2D在抗肿瘤免疫中占有重要地位。NKG2D在结肠癌患者的NK细胞/T细胞上的表达降低已得到证实13。本研究结果显示，与正常人相比食管癌患者外周血NK细胞NKG2D表达降低，同时外周血NK细胞毒活性降低，提示食管癌可通过下调NK细胞功能而逃逸免疫系统的监视。4060Gy的放疗剂量时NK细胞外表NKG2D表达显著上调，NK细胞毒活性最强，提示放疗剂量不是越高越好，过高的剂量不但损伤周围正常的

18、组织，而且损伤了患者的免疫功能，结果虽然进步了肿瘤的部分控制率，反而降低了患者的远期生存率。另一方面，4060Gy的放疗剂量引起NKG2D阳性的NK细胞数增加及NK细胞毒功能增强的原因并不清楚，可能与放疗杀死肿瘤组织、降低肿瘤负荷有关。而sIA在放疗后无明显变化可能与本研究搜集样本相对较少有关，扩大样本量可带来更明确的结果。同时，本研究亦提示自肿瘤细胞脱落的sIA仅是下调NK细胞功能的原因之一，而肿瘤细胞分泌的转化生长因子-(TGF-)和IL-10可能是抑制免疫功能的更重要因素14。总之，在肿瘤的临床治疗中，当我们为了进步肿瘤的部分控制率不得不予以高剂量的放疗时，可与免疫增强疗法联用，不仅可进

19、步肿瘤的部分控制率，还可延长患者的远期生存率。【参考文献】1GasserS,RauletDH.TheDNAdaagerespnsearusestheiunesysteJ.anerRes,2022,66(8):3959-3962.2龚卫娟，范丽安.IA基因研究进展J.国外医学遗传学分册，2001，24(4)：181-187.3GrhV,uJ,Yee,etal.Tur-derivedslubleIli-gandsipairexpressinfNKG2DandT-ellativatinJ.Nature,2002,419(9):734-738.4uJD,HigginsL,StEinleA,etal.P

20、revalentexpressinftheiunstiulatryHlassIhain-relatedleuleisunteratedbysheddinginprstateanerJ.JlinInvest,2022,114(4):560-568.5DubrvinaES,Dubrvin,ViderE,etal.EvasinfrNKelliunitybyHlassIhain-relatedleulesexpressinglnadenarinaJ.JIunl,2022,171(12):6891-6899.6JunainsngA,RphrukAV,JearanaiknP,etal.Assiatinfp

21、lyrphiextraellulardainsfIAithervialanerinnrtheasternThaippulatinJ.TissueAntigens,2022,69(4):326-333.7TaakiS,SanefuziN,Kaakai,etal.AssiatinbeteenslubleIAlevelsanddiseasestageralsquausellarinainJapanesepatientsJ.HuIunl,2022,69(2):88-93.8刘晓静，龚卫娟，龚春香，等.高能X线照射对肿瘤细胞表达IA及NK细胞功能的影响J.实用临床医药杂志,2022，13(5)：21-23.9GnzlezS,Lpez-StA,Suarez-AlvarezB,etal.