培养基的配制与灭菌技术

1、 /11实验一培养基的配制与灭菌技术一、目的要求1掌握配制培养基的一般方法和步骤。2学习高压灭菌锅的操作方法。二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NACL提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96时溶化，一般实际应用时在下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40时凝固，通常不被微生物分解利用。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。高氏1号培养基是分离和培养放线菌的

2、合成培养基，是由可溶性淀粉作碳源，KNO3作氮源，NaCl，K2HPO4.3H2O,MgSO4.7H2O，FeSO4.7H2。为微生物提供钠、钾、磷、镁、硫高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，这种

3、潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。通常为15磅/英寸2(121.3)灭菌1520分钟；不耐高压的培养基则可采用流通蒸汽灭菌或间歇灭菌。含糖培养基用112.6(8磅/英寸2)灭菌15分钟。紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；由于辐射能使空气中的氧电离成O再使。2氧化生成臭氧。3或使水电。氧化生成过氧化氢为。2,。3和%。2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。三、器材天平，高压蒸汽灭菌锅，电烘箱，

4、1mol/LNaOH,1mol/LHC1,培养皿，试管，吸管，酒精灯，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，接种环，牛角匙，pH试纸(pH5.5操9.0),棉花，纱布，牛皮纸，记号笔，麻绳。四、操作步骤称量培养基的配方见附录I。溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积。配制高氏1号培养基时，用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化，再称取其他各成分依次逐一溶化，对微量成分FeSO4.7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100ml水中加入1g的FeSO4.7H2O配

5、成0.01g/ml，再在1000ml培养基中加入1ml的0.01g/ml的贮备液即可。将马铃薯块放入少于所需水量的水中，在石棉网上加热，搅拌以免马铃薯块糊在烧杯底，煮沸20分钟，经常补充水分，将马铃薯及煮沸液经4层纱布过滤，补充水分到所需体积，加入称量的糖。调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/LHCl进行调节。注意pH值不要调过头，以免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其PH的调节可用酸度计进

6、行。分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内（见图11）。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面；分装三角瓶的量以不超过容积达一半为宜。加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内。生理盐水的配置分装用吸管量取相应体积的生理盐水。图1-1分装.包扎加塞后，将全部试管用橡皮筋捆扎好，再在棉塞外保一层牛皮纸或报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用橡皮筋扎好。用记号笔注明培养基名称，日

7、期。.灭菌(1)首先将内层灭菌筒取出，再向外层锅加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。(2)放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞，(3)加盖，将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。(4)通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。(5)灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物

8、品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。.搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50C左右，将试管棉塞端搁在木条上(见图12)。图1-2搁置斜面图1-图1-2搁置斜面.倒平板将培养基溶化，待冷至5560时，将几种培养基分别倒平板，每种培养基倒三皿。手持法(见图-5)：右手持盛培养基的试管或三角瓶，置火焰旁，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。如果试管内或三角瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养

9、基约15ml，加盖后，轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即可成平板。皿架法(见图工-4)：将平皿叠放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇均后制成平板。图工-图工-4皿架法图1-5手持法.无菌试验将已灭菌的培养基，置无菌试管内，放在37孵箱中培养24小时，将取出的灭菌培养基放入37温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。五、实验报告.如何检验灭菌后培养基是否合格？.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待降到0时才能打开排气阀，开盖取物？附录I培养基的配置、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）牛肉膏3g

10、蛋白胨10gNaCl5g琼脂1520g水1000mlpH7.4-7.6配置时，按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。牛角匙称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品。将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。、高氏1号培养基（培养放线菌用）可溶性淀粉20gNaCl0.5gKNO31gK2HPO

11、4.3H2O0.5gMgSO4.7H2O0.5gFeSO4.7H2O0.01g琼脂1520g水1000mlpH7.4-7.6配置时，淀粉单独称量在50ml小烧杯中。、马铃薯培养基（培养真菌用）马铃薯200g蔗糖20g琼脂1520g水1000mlpH自然配置时，马铃薯去皮，切成小块，称量。实验二土壤微生物的分离一、目的要求学习无菌操作技术掌握几种分离纯化微生物的基本方法二、基本原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯

12、化。一般根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求的不同，供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。三、器材肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏1号琼脂培养基，马铃薯琼脂培养基，10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素，菜园土，玻片，酒精灯，革兰氏染液。四、操作步骤制备土壤稀释液称取土样10

13、g,放入盛90ml生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20分钟，将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一只无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一装有9ml无菌水的试管中，以此类推，制成10t，10-2，10-3，10-4，10-5，106稀释度的土壤溶液。涂布或划线将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上104，105，106三种稀释度，然后用三支1ml无菌吸管分别由10-h105,106三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入写好稀释度的平板中，用无菌玻璃推子在培养基表面轻轻涂布均匀（见图口-1）o用接种环以无菌

14、操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养基约70。角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后将接种环搭在平行线上作第二次平行划线，同样作第四次划平行线，划线结束后，盖上皿盖（见图口-2）o图口-1涂布过程图口-1涂布过程图口-2平板划线分离法A.涂棒浸入酒精B.火焰烧涂棒，冷却a.交叉划线法（1、2、3、4依次为划线的起点）培养将涂布或划线后的培养基平板倒置于不同温度的温箱中培养并观察生长情况。挑菌将培养后长出的单个菌落，挑取接种到斜面上，分别置28和37温箱中培养，待菌苔长出后，检查菌苔，显微镜涂片观察判断是否是单一的微生物，若有其他杂菌，再一次进行分离纯化。鉴

15、定对分离得到的细菌的进行生理生化反应测定。参考相关微生物鉴定手册。1、在选择培养基上是否分离到细菌？根据在1,10-1,10-2三种稀释度平板上分离得到的单菌落，确定最佳稀释浓度。2、在平板划线法中，为什么每次都需将接种环上的剩余物烧掉？3、为什么要将培养基倒置培养？附:、丝状真菌（霉菌）的分离纯化（1）分离源:菜园土（2）培养基马铃薯培养基：马铃薯200g蔗糖20g琼脂15-20g水1000ml马丁培养基：蛋白胨5gMgSO47H2O0.5g葡萄糖10gKHPO421.0g琼脂18-20gHO21000ml加入1%孟加拉红水溶液3.3ml,121,20min灭菌。使用前，每100ml培养基加

16、入1%链霉素溶液0.3ml。查氏培养基：蔗糖30gFeSO40.01gNaNO32.0gMgSO47H2O0.5gK2HPO41.0gH2O1000mlpH值自然2115,灭菌20min（3）方法将分离用的样品，用无菌水制成一系列10倍稀释悬液。根据样品来源选择适当的培养基。分离土壤样品较多采用马丁琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基；霉变材料及河塘泥、生物膜等样品中霉菌的分离多采用查氏琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂、或马丁氏琼脂等。用无菌吸管分别吸取0.5-1ml不同稀释度的菌悬液，接入无菌平板，按常规的混菌法或涂布法进行分离操作。每个稀释度一般做三个平皿。置于2328培养37天，待菌落长好作进

17、一步分离纯化。依据菌落形态、质地和正反面颜色，判断是否为纯培养物。如有细菌或其他杂菌污染，则可挑取霉菌孢子或菌丝，用平板划线法重复分离纯化。对于形成固定菌落的如青霉、曲霉等，可用稀释平板混菌法分离纯化。菌落不定形、蔓延繁殖的如根霉、毛霉等，因两个菌落极易接触混杂，故分离时需采用较高的稀释度或以培养1624小时生长的菌丝接种。二、放线菌的分离纯化（1）分离源:菜园土（2）培养基：高氏1号培养基（培养放线菌用）可溶性淀粉20gKNO31gMgSO4.7H2O0.5g琼脂1520gpH7.47.6NaCl0.5gK2HPO4.3H2O0.5gFeSO4.7H2O0.01g水1000ml三、酵母菌的分

18、离纯化（1）分离源：果园土，水果表皮，腐烂水果，酸牛奶（2）培养基：乳酸马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200g乳酸5ml葡萄糖20g水1000ml马铃薯去皮，切块，取200g,加水煮沸30min,纱布过滤，补足水至1000ml,加入其他成分即可，条件为115,20山邛口自然。（3）富集培养将待分离样品放入盛有无菌水与玻璃珠的三角瓶中,使样品振荡分散后取上清液,接种于乳酸马铃薯葡萄糖培养基中,2528培养37天,培养液变混浊,产生菌膜或沉淀物，取富集液，经适当稀释，吸取0.2ml接入乳酸一马铃薯一葡萄糖琼脂平板，用涂布器涂布，正放于2528,培养24h,表面水分吸干后再倒置培养。四、纤维素分解菌的分离纯化分离源草地表层土壤、堆腐烂植物体、湖水等。培养基：蛋白胨10g酵母粉10g羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10gNaCl5gKHPO241g琼脂粉18g蒸馏水1000mlKHPO24