中药复方对2型糖尿病大鼠的胰腺中Bcl2、Bax表达的影响

1、中药复方对2型糖尿病大鼠的胰腺中Bcl-2、Bax表达的影响【摘要】目的研究中药复方本草消渴丹对糖尿病模型大鼠胰腺组织凋亡相关基因Bl-2和Bax表达的影响，讨论复方中药治疗糖尿病的作用机理，为临床用药提供科学根据。方法将32只istar大鼠随机分为正常对照组8只，造模组24只。造模组给予高糖、高脂饲料3周后，一次性腹腔注射小剂量链脲佐菌素STZ，25g/kg，继续予高糖、高脂饲料4周，造模成功后，随机分为糖尿病模型组、复方中药治疗组和阳性药物对照组，分别给予生理盐水、本草消渴丹和二甲双胍片灌胃4周，每周末断尾取血检测空腹血糖值。治疗4周后检测各组大鼠血糖变化，用RT-PR检测胰腺凋亡相关基因

2、Bl-2和Bax的表达变化。结果中药复方治疗组糖尿病大鼠的体质量增长明显比模型对照组快，血糖程度、血糖曲线下面积均低于模型对照组，凋亡相关基因Bl-2的表达升高，而Bax表达降低。结论本草消渴丹治疗糖尿病的机制之一是通过抑制胰腺细胞的凋亡来实现的。【关键词】中药复方；糖尿病；凋亡；Bl-2；Bax；胰腺糖尿病是一种常见的内分泌系统代谢障碍性疾病，其发病率有逐年上升趋势，其特征性表现为高血糖和糖尿。西医方面虽有多种治疗方法和药物，但由于西药的毒副作用，使西药在糖尿病的治疗方面未能获得打破性进展。近年来，中医药在防治糖尿病方面表现出宏大的潜力，无论是单味中药还是中药复方，在治疗糖尿病方面均显示出很

3、大优势1,2。本实验以验方生地、山药、枸杞和山萸肉为根底经提取制本钱草消渴丹，通过干预2型糖尿病大鼠模型，观察其对2型糖尿病大鼠血糖和胰腺凋亡相关基因Bl-2和Bax的表达的影响，为临床用药提供科学根据。1材料与仪器1.1药物将复方中药主要成分：生地20g，山药20g，枸杞子10g，山萸肉15g分别用醇提水沉法提娶浓缩、枯燥、制成颗粒剂，每克颗粒剂相当于原药材9.2g，由河北大学医学部药剂教研室提供，以上药材购自保定市中药饮片。盐酸二甲双胍片，规格每片0.25g，由天津太平洋制药提供，批号071204；链脲佐菌素STZ由美国Siga提供，批号S-0130；TRI-ZL和RT-PR药盒等购自GI

4、B-BRL公司,100bpDNA梯度标记物为PREGA公司产品。其他试剂均为市售产品。1.2仪器AR1530电子分析天平(1/1000，美国奥豪斯)；GT-1640京都血糖仪SUPERGLUARD及试纸(由日本ARKRAY，Int提供)；PR仪，型号T1/T1+，德国Bietra消费；SP-2102/756型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器消费；凝胶成像系统，BI-RADpany消费。1.3高脂饲料的制备3根底饲料：碳水化合物占60%，蛋白质占22%，脂肪占10%(植物脂肪为主)，其它成分占8%。高脂、高糖饲料由根底饲料加炼猪油10%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%、胆酸钠1%，其中碳

5、水化合物占50%，蛋白质占13%，脂肪占30%(动物脂肪为主)，其它成分占7%，由河北医科大学医学动物实验中心加工成饲料颗粒。1.4动物清洁级安康雄性ister大鼠32只，体质量281.1811.38g，由河北医科大学实验动物中心提供合格证号604104，饲养在室温2025，相对湿度40%70%的环境条件下，每笼8只，共分4笼，自由采食、饮水。2方法2.1造模与分组3将上述大鼠适应性饲养1周后，称重，随机分为两组，第1组8只为正常对照组，喂以根底饲料，第2组24只大鼠用于构造2型糖尿病模型。构造模型组以高脂、高糖饲料饲喂3周后，一次性腹腔注射STZ25g/kg体质量(STZ溶于柠檬酸-柠檬酸钠

6、缓冲液，所配浓度为10g/l)；对照组腹腔注射相应体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。构造模型组继续高糖、高脂饲料饲养4周后，禁食12h，按2g/kg体质量灌喂20%D-葡萄糖溶液，做口服葡萄糖耐量试验，凡0in和120in血糖分别7.8l/L或葡萄糖负荷后2h血糖11.0l/L的大鼠4为造模成功。选择造模成功的大鼠24只按体质量编号，参照随机数字表法分为3组，分别为模型组、二甲双胍组、本草消渴丹治疗组。各组均继续喂以高糖高脂饲料4周，并每周称体质量。2.2治疗第7周后，各组动物分别灌胃相应药物或生理盐水，1次/d，给药按人与大鼠体外表积比折算成等效剂量。对照组、模型组分别每日灌胃等剂量的生理盐水；

7、二甲双胍组每日灌胃二甲双胍70gkg-1，中药治疗组每日灌胃本草消渴丹1.25gkg-1。2.3糖耐量实验实验期末空腹8h采尾静脉血后，以50%葡萄糖溶液灌胃，剂量为2.5g/kg，然后检测在0，0.5，1，2h后的血糖。由梯形累加法计算血糖曲线下区域面积areaunderurve，AU，lh-1L-1。转贴于论文联盟.ll.2.4RT-PR检测胰腺Bl-2，Bax基因表达程度4周实验完毕后，各组大鼠断颈处死，搜集胰腺利用Trizl试剂提取总RNA，逆转录合成DNA。根据NBI中DNA序列设计Bl-2和Bax引物，引物由大连宝生物公司合成，以-atinRNA作为检测的内参照。根据试剂盒说明进展

8、RT-PR，反响总体系为50l：10neStepRNAPRBuffer5l，gl2(25l/L)10l，dNTPixture(10l/L)5l，RNaseinhibitr(40U/l)1l，AVRTaseXL(5U/l)1l，AV-ptiizedTaq(5U/L)1l，上游特异性引物(20l/L)1l，下游特异性引物(20l/L)1l，RNAsaple(1g)1l，RNaseFreedH224l。取10l样品在2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描凝胶并进展定量分析，以-atin为标准获得Bl-2和Bax的相对表达程度。PR反响引物序列产物及退火温度见表1。表1RT-PR的引物序列、退火温度和产

9、物长度略2.5数据分析应用SPSS15.0的ne-ayANVA进展方差分析，组间进展LSD法多重比拟。3结果3.1实验前后血糖变化和糖耐量实验结果实验开场时，正常组与其他各组的空腹血糖都存在显著差异P0.05，4周后正常组和模型组的血糖都没有显著变化P0.05，而二甲双胍组和本草消渴丹组的血糖都显著降低P0.01。本草消渴丹组4周后空腹血糖值显著低于模型组P0.01，与二甲双胍组和正常组间的差异无统计学意义P0.05。糖耐量实验发现本草消渴丹组AU显著高于正常组P0.05，显著低于模型组P0.05，与二甲双胍组间的差异无统计学意义P0.05。见表2。表2各组大鼠实验前后的空腹血糖变化和糖耐量实

10、验结果略3.2胰腺Bl-2和Bax表达变化本草消渴丹组的Bl-2基因表达程度与正常组和二甲双胍组间无显著差异P0.05，与模型组间存在显著差异P0.05。正常组与其他各组Bax基因的表达都存在显著差异P0.05，该基因的表达在二甲双胍组和本草消渴丹组显著低于模型组P0.05，本草消丹组与二甲双胍组间无统计学差异P0.05。见表3和图1。表3Bl-2和Bax的RNA表达程度略与正常组比拟存在显著差异，*P0.05，与模型组比拟存在显著差异，P0.054讨论现代医学认为，胰岛细胞的凋亡是糖尿病发病的重要机制5。凋亡受基因调控，其中最有效的调控物质是Bl-2基因家族，它们在凋亡的基因调控中起着中心作

11、用6。Bl-2Belllypha-Leukeia-2，B细胞淋巴瘤/白血病-2基因是Bl-2家族成员中主要的抗凋亡因子，在抵抗细胞凋亡及延长细胞寿命方面的作用最具代表性，而Bax是凋亡促进基因。它们形成二聚体，调控蛋白酶和核酸酶活性，双向调节细胞凋亡。二者在细胞中的比例决定了细胞是否凋亡，当Bl-2蛋白在细胞中过量表达时，与所有Bax结合，细胞存活，凋亡抑制；当Bax过量存在，与Bl-2形成异源二聚体，那么细胞凋亡79。中医理论认为，糖尿病的主要病证为本虚标实，阴虚热盛、气阴两虚、阴阳两虚三证分别代表糖尿病病程开展的早、中、晚3个不同时期，其中阴虚贯穿本病始终，气阴两虚为其根本证候，血瘀为主要

12、兼证10。现代医学研究证明，生地黄为甘寒滋补通利之品，可以通过抑制血管内皮细胞血浆内皮素的释放而发挥抗血瘀作用11，12；山药提取物山药多糖和枸杞的重要成分枸杞多糖均有改善糖尿病鼠受损细胞，降低血糖之成效1316；而山萸肉有补益肝肾，涩精固脱之成效17。中药复方本草消渴丹是根据滋阴清热，润燥生津这一治那么，在传统古方根底之上主要选用生地、山药、枸杞和山萸肉，经过现代工艺研制而成的新制剂。本次实验结果说明，糖尿病对照组胰腺组织中抗凋亡基因Bl-2表达显著降低，凋亡促进基因Bax显著升高，而通过灌服二甲双胍2.13g/10gd后Bl-2表达恢复正常程度，Bax表达虽有降低，但没有恢复正常程度。灌服

13、中药复方的糖尿病大鼠的Bl-2表达恢复至正常程度，而Bax表达高于正常大鼠。说明本草消渴丹有上调糖尿病变大鼠凋亡抑制基因Bl-2表达和下调凋亡促进基因Bax表达的作用，从而抑制糖尿病胰腺-细胞的凋亡，其效果与二甲双胍一样，可以作为治疗糖尿病的方剂。【参考文献】1王芬，何华亮，刘铜华.抗糖尿病中药活性成分及其作用机制的研究进展J.时珍国医国药，2022，192：766.2李成，杨长青，朱彩凤.中药治疗糖尿病的研究进展J.时珍国医国药，2022，175：857.3穆松牛，高云，万福生，等.链脲佐菌素加高糖高脂饮食复制大鼠2型糖尿病模型J.中国比拟医学杂志，2022，122：19.4周强，金智生，张

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