免疫磁珠法分离和提纯雪旺细胞的实验研究

1、免疫磁珠法别离和提纯雪旺细胞的实验研究【摘要】目的讨论利用免疫磁珠从SD大鼠坐骨神经别离培养获得大量、高纯度雪旺细胞的方法。方法选用47dSD大鼠，无菌条件下取双侧坐骨神经，解剖镜下剥离去除神经外膜，获得神经束，将神经束剪碎至13大校采用双酶2次消化法消化，胎牛血清中止消化后，离心并参加DF12培养液培养。7d后应用免疫磁珠法对细胞进展纯化培养，培养2d后进展传代接种。培养过程中对细胞进展形态学观察、计数及活力测定；TT法绘制细胞生长曲线，采用免疫细胞化学荧光染色对细胞进展鉴定并且计算所得细胞纯度。结果别离培养所得细胞即为雪旺细胞；采用免疫磁珠法能对培养所得雪旺细胞进展纯化。纯化后雪旺细胞活力

2、为96%0.5，纯度98%1.1%，培养2d后就可以传代。结论免疫磁珠法可以用于雪旺细胞的纯化培养，所得雪旺细胞纯度高，活力强，能满足组织工程人工神经的需要。【关键词】雪旺细胞；免疫磁珠；坐骨神经Keyrds：Shannell;iunagnetiheads;siatinerve雪旺细胞Shannell，S是周围神经系统的主要胶质细胞，包绕周围神经的轴突，形成髓鞘1。现已证明周围神经的再生才能主要归功于雪旺细胞，它能分泌少量神经营养因子促进神经轴突的发芽再生；其分泌的细胞外基质可以形成类髓鞘的管状构造，为再生轴突的延伸和生长提供隧道2。雪旺细胞可以起到神经轴突的“导管、“导向作用。所以目前认为雪

3、旺细胞在周围神经损伤修复及神经组织工程中有良好的应用前景；但如何快速获取大量高纯度、高活性雪旺细胞是移植的关键。雪旺细胞培养的组织来源多为周围神经和背根神经节组织3，为获得高纯度的细胞，培养的关键在于去除沾染的成纤维细胞4、5，同时保持雪旺细胞较长时间的生存增殖才能。雪旺细胞培养的方法主要有：组织块培养法、单酶消化法及双酶消化法等。对于各种方法的优劣，文献报道不一。为此，本实验希望尝试通过免疫磁珠来培养及纯化雪旺细胞，为神经组织工程进一步研究打下基矗1材料与方法1.1实验材料实验动物47d的SD仔鼠35只,雄性。由第四军医大学动物研究所提供。培养液DF12培养液Gib、胎牛血清Gib。消化用酶

4、0.25的胰蛋白酶Siga和0.2的型胶原酶Gib。1.2细胞别离1.3细胞纯化1.4细胞计数1.5TT法绘制雪旺细胞生长曲线计算倍增时间：取两组传代雪旺细胞悬液，调整细胞浓度为1104/l，接种于96孔培养板，每块板每组取8孔，200l/孔，共接种9个样本。37，52培养3d。培养3d后，每日固定时间取板1块，加5g/LTT试剂20l/孔，37，52孵育箱中4h；弃上清，加DS150l/孔，振荡10in，酶联免疫检测仪测吸光度值(A值/D值)，激发波长：490n，计算当日各组A值均数，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制生长曲线。倍增时间计算：DT=tlg2/lg(Nt/N。)(DT为A值增加1

5、倍的时间，Nt为t时问的相对A值，N。为培养第1d的相对A值)。1.6细胞鉴定1.7细胞纯度将纯化的雪旺细胞进展消化，取1滴细胞悬液滴于盖玻片上，37温箱中培养24h后取出，采用间接免疫荧光法或AB法进展鉴定。纯度计算法：随机选取10个高倍镜1020下不同视野，间接荧光法以普通光下见到的细胞数为细胞总数，以荧光激发后镜下发荧光的亮绿色的细胞为阳性细胞：AB法以蓝色细胞核数为总细胞数，以胞浆显色者为阳性细胞数。转贴于论文联盟.ll.阳性细胞数总细胞数100阳性细胞百分数，亦即雪旺的纯度。2结果2.1雪旺细胞的形态学鉴定采用胰蛋白酶和胶原蛋白酶混和消化后细胞存活率为96.4%2.1，细胞在接种12

6、d后可观察到少量雪旺细胞贴壁，胞体以梭形为主，少数为三角形，局部细胞已伸出双极突起，细胞核为圆形或卵圆形。35d后，出现聚合现象，呈旋涡状或栅栏状排列生长。随着培养时间的延长，突起更加细长，细胞间排列更严密，形成网络状。雪旺细胞和成纤维细胞成双层生长，雪旺细胞多数呈梭形，少数呈三角形或不规那么形，胞体较小，具有两个细长的突起。成纤维细胞的胞体较大，扁平，呈不规那么形，无细长突起，覆盖于瓶底，雪旺细胞在其上生长。7d后成纤维细胞的数量逐渐增多，因其生长速度快，很快即铺满瓶底，雪旺细胞那么随后生长于其上。经免疫磁珠提纯的雪旺细胞多为胞体较孝具有两个极状突起的梭形细胞，少数为三角形或不规那么形。纯化

7、培养2d后，雪旺细胞活力96%0.5，纯度98%1.1，增殖良好。2.2雪旺细胞鉴定2.3雪旺细胞增殖才能测试用测得的TT吸光度值(A值D值)绘制细胞生长曲线。结果显示培养27d的2代雪旺细胞处于对数生长期(图3)。倍增时间为3d。图2免疫荧光染色20图3雪旺氏细胞生长曲线3讨论雪旺细胞是外周神经的神经胶质细胞，在神经系统的发生、发育，特别是神经再生中起着重要作用。随着神经组织工程的开展，需要获得大量高纯度的雪旺细胞，目前主要的培养方法有组织块培养法、单酶消化法、双酶消化法、特异粘附法等69。但这些方法均有获得细胞纯度低、数量少、不易长期存活等问题。本试验采用0.25胰蛋白酶加0.2型胶原酶二次消化法，消化1h后神经束根本消化完全，活细胞率可达94.63.410。本方法使用较低浓度的胰蛋白酶进展消化，减少了对雪旺细胞的损伤，消化