竞赛最终版不同来源细菌对氟苯尼考的耐药性分析及其floR基因传播机制

1、方法 采5种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC），并通过生化指标结16srDNA 进行细菌鉴定；聚合酶链反应（PCR）检测的携带情况，Southern 杂交对其进行定位；脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术分析大肠杆菌的同源性；质粒结合转移、转座子检测分析其水平转移机制。结206 株分离株中，以大肠杆菌最为常见占50.97%128（62.14%）株耐氟尼考阳性菌120 株（58.25%），为氟苯尼考耐药菌株。的质粒上，且其上下通常伴随着转座子结构。论物。氟苯尼考已在亚洲、欧洲、美洲等 20 多个国家上市，主要用于猪、牛、鱼及禽类疾病的治疗2。但由于3-5，甚至也发现了对氟苯尼考耐药的人源大肠杆菌6。的f

2、loR floR 材料与方法Solabio 。PCR Thermo Dinco ATCC25922 源的样本，根据伯杰细菌鉴定手册第八版716srDNA 鉴1.2.2 琼脂二倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC） 琼脂稀释法测定分离菌种对氟苯尼考等 5 MIC 0.5 的菌悬液稀释 10 倍，将稀释的菌液移至 96 琼脂吸收后，371824hMIC 标准化机构(CLSI)的标准判断8按临床1.2.3 PFGE Bio-radCHEFMapperXA 冲场电泳系统进行分析，酶切体系：2.0LXbaI，12.0L10XbaIBuffer，12.0L0.1%BSA，94.0L 双蒸水，376V/cm53

3、5s12019h。电泳结束后，获取保存图像，用 BioNumerics software 进行分析，UPGMA1.2.3 PFGE Bio-radCHEFMapperXA 冲场电泳系统进行分析，酶切体系：2.0LXbaI，12.0L10XbaIBuffer，12.0L0.1%BSA，94.0L 双蒸水，376V/cm535s12019h。电泳结束后，获取保存图像，用 BioNumerics software 进行分析，UPGMA 方法对 PFGE 图谱聚类分析。1.2.4 PCR 数据库中的 1.2.5 floR 。的1341 变性处理后进行电转，20V90min；交联，12030min；预杂

4、交，424h；杂交，4216h 1.2.5.2 质粒接合转移实验 EC600 2mLLB 液体培养基中，37LB 1:100 稀释，374h；取供体菌 500L 500L 3mLLB 37孵育过夜，受体菌和供体菌也同100L 64g/mL2048g/mL)，3718-24hMH 平板上生长的接合子菌落作菌种鉴定、PCR DNA PCR DNA DNA PCR UltraEdit 、BioEdit 、clustalx 结细菌分布情况 试验分离的 206 16srDNA 1 为大肠杆菌，占 2.2 206 5 均有不同程度的耐药性，且多重耐药现象严重（占 93.20%），其中对 5 种抗生素全耐药

5、的有 107 株占 128（62.14%）株耐氟苯尼考菌株（1）100.00%，并且在水和floR筛查结果 菌落 PCR 扩增结果（2） 带了 。2.4 PFGE 18 15 3 15 阳11 0.54 0.92 之间，细菌多样性程度不高，3 0.86, 11 14 2.5 克雷伯菌 1341 的序列，设计探针对 定位分析 根据已完成全组的 1 不同来源细菌生化鉴定11 0.54 0.92 之间，细菌多样性程度不高，3 0.86, 11 14 2.5 克雷伯菌 1341 的序列，设计探针对 定位分析 根据已完成全组的 1 不同来源细菌生化鉴定结（4）1 不同来源细菌对不同抗生素的耐药结2 PC

6、R 产物凝胶电泳注：M：100bp DNA ladder；1-4：398bp 引物PCR 产物5-8：290bp 引物PCR 产4 Southern 杂交电泳图及显色条3 不同来源细菌经XbaI 酶切PFGE 图谱及聚类分2.6 接合试验 EC600 MIC 46 2.7 的侧翼序列 对定位于。1341 TnpA 转座子结构（6）17861CE078 PT078 100%R55 PCCK381 97% 的同源性（ 120大肠杆菌 克雷伯菌 气单胞菌 沙门菌 志贺菌头孢其噻他5氯霉素3 4 恩诺沙5虾源0004550200002002033803牛源4 虾源 2 12 株接合子的耐药情5 接合子

7、接合前后质粒对比电泳图注M：LambdaDNA/HindIIIMarker；1,3,5,7,9,11：接合前质粒 DNA；2,4,6,8,10：接合子质粒 DNA图 2 12 株接合子的耐药情5 接合子接合前后质粒对比电泳图注M：LambdaDNA/HindIIIMarker；1,3,5,7,9,11：接合前质粒 DNA；2,4,6,8,10：接合子质粒 DNA图 克雷伯菌1341 质粒上的侧翼序7 clustalx 多重序列比对结3广泛应用9。氟singer 等人10MIC32 Kim 等人11岛上。Blickwede 等12分析了猪源耐氟苯尼考大pMBSF13 Tn5393E.coli10

8、660 Tn1721 和环境的 1 2 3 焦志峰. D. 华2013 , 萧志梅. 氟苯尼考的临床应用及市场状况. 中国兽药杂志2000,34(553-ArcangioliMA,Leroy-SetrinS, 1 2 3 焦志峰. D. 华2013 , 萧志梅. 氟苯尼考的临床应用及市场状况. 中国兽药杂志2000,34(553-ArcangioliMA,Leroy-SetrinS,J L,Chaslus-DanclaE. AnewhenicolandedbyegronstructuresinSalmonellatyphimuriumDT104.FEMSMicrobiolLett,1999,1

9、74(2):327- 4 BoltonLF,KelleyLC, LeeMD, Fedorka-CrayPJ,MaurerJJ.Detectionofmultidrug-resistantSalmonellaserotypetyphimurium DT104basedonagenewhichconfersMicrobiol,1999,37(5):1348-toflorfenicolandhenicol.J 5 KimE,AokiT. ysisofthegenehelasmidofapathogen,Pasteurellapiscicida.MicrobiolImmunol,1996,40(9):

10、665-Fernandez-AlarconC,SingerRS,JohnsonTJ. Comparativegenomicsof 6 -encodingIncA/Cfromcommensaland, cherichiacolifrommultipleanimal. PLoSOne,2011,6(8): 7 ,手册审校组校, 伯杰细菌鉴定手册M. 科 8 ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.tandardsforAntimicrobialDiskandDilutionSusceptibilityforBacteriaIsolatedFromAnimals-FourthEdition:ApprovedStandardVETO1-A4.CLSI,Wayne,PA,USA, 9 10田丽粉. 氟苯尼考在牙鲆体内的药代动力学及残留消除规律研究D. 中国海洋大学2009,Fernandez-AlarconC,SingerRS,JohnsonTJ. Comparativegenomicsof-encodingIncA/Cfromcommensalandcherichiacolifrommultipleanimal. PLoSOne,2011,6(8): 11KimE,AokiT.ysisofthegenehelasm