梭子蟹变应原的分离、纯化

1、梭子蟹变应原的别离、纯化purifiatin,identifiatinandharaterizatinftheajrallergenfrlinnaeusthesendaffiliatedhspitalfguangzhuedialllege,guangzhu510260,hina蟹是引起过敏的最常见的海产品之一，蟹的种类很多，在我国就有600多种，有梭子蟹、雪蟹、青蟹等等，是超敏反响人群中最主要的食物性因素之一。临床表现有腹痛、腹泻、呕吐、皮疹、鼻炎、头痛、血管性水肿、哮喘和威胁生命的过敏反响1。国外早有报道，职业性哮喘在雪蟹加工厂的工人中非常普遍，其皮试反响、血清中结合蟹提取物的特异性ige的

2、升高与职业性哮喘存在显著的相关关系2。近年来，国外有资料报道，雪蟹第一个被鉴定的主要变应原的分子量是340003。也有报道显示，雪蟹的致敏蛋白条带是2500045000、14000或14000以下，97000、38000410004。梭子蟹俗名花蟹，属梭子蟹属，梭子蟹科，在动物分类上，属于节胶动物门甲壳纲，由于形似织布用的梭子和蟹壳呈花斑状而得名，是最常见的大型淡水经济蟹类，肉味鲜美，营养丰富，是人们的常见食品，在我国华南地区养殖业占有重要的地位。其变应原的纯化和鉴定国内外至今未见有报道。因此，我们选用梭子蟹进展别离纯化，获取梭子蟹天然的主要变应原，同时对其变应原特性进展鉴定，为标准化变应原疫

3、苗的研制提供理论根据，以讨论对变态反响疾病更平安、更准确的诊断方法。1材料与方法1.3梭子蟹的采集和粗浸液的制备新颖梭子蟹于中国水产研究所定点采购，参照乔秉善编?变态反响学实验技术?5。除去梭子蟹硬壳局部，用刀剁碎蟹肉后按其12/v的比例浸泡在95%酒精中脱水，在室温下搅动12小时后倒出上清液，参加新颖溶剂，反复操作3次后，放37风干。把风干的蟹肉放组织搅碎机搅碎，过40目筛孔径0.45，除去材料中的杂质。用21的丙酮和乙醚脱脂3次。按1g参加提取缓冲液ph7.425l的比例提取蟹浸液，置冰箱4浸泡48小时，期间每日搅拌2小时。后经5000r/in离心15分钟，汲取上清，把上清透析、冻干备用。

4、1.4血清来源与制备以临床病史、皮试和uniap(pharaia)检测为根据，选取2002年8月到2022年3月我科门诊蟹过敏病人26例。取无蟹过敏史、皮试和uniap(pharaia)蟹检测阴性为对照。取其血液别离血清，分装，置-80保存。1.5方法2结果2.2esternblt鉴定梭子蟹致敏蛋白取对蟹过敏的病人26例的血清作为一抗，同时取正常人血清5号作阴性对照，分别进展免疫印迹，26例病人血清含特异性ige均有阳性带出现，从图2可以看出浸出液中明晰可见的致敏带有5条，主要变应原组分是74400、48700，两条带都分别与26例蟹过敏患者血清特异性ige显阳性反响，阳性反响率均为100%，

5、为梭子蟹主要变应原；分子量在89100的大分子区带有8例病人血清有特异性ige反响，阳性反响率30%；33700和29200的蛋白带有1例病人血清血清号是19418有阳性反响，阳性反响率均为3.8%，为梭子蟹浸出液的次要变应原；而正常人血清那么呈阴性反响，见表1。nte:.leularassstandards;1.theruderabextrat.图2esternblt鉴定梭子蟹致敏蛋白略fig.2iunstainedesternbltfsandsiingraballergen表1通过esternblt鉴定的梭子蟹致敏组分略tab.1identifiatinftheallergipnentsf

6、separatedrabextratbyesternbltanalysisnte:1.therudeextratfsiingrab;2.thefirstpeaklletinfhratgraphyyield;3.thesendpeaklletinfhratgraphyyield.图7梭子蟹别离纯化后的致敏蛋白esternblt鉴定略fig.7esternbltidentifiatinfthepurifiedsandsiingraballergennte:.leularassstandards;1.thepurifiedrabprteinpnentsreatedithraballergenpsit

7、ivesera.2.5纯化后主要变应原的免疫活性纯化后主要变应原组分：74400和48700的蛋白具有变应原活性，见图7。3讨论根据国外对蟹变应原的研究报道，hefle等4采用雪蟹肉提取物与18个过敏血清标本反响，10例与分子量在2500045000的蛋白条带特异性ige显阳性反响，5例与14000或14000以下的蛋白条带特异性ige结合，2例显示只与14000的条带和2例显示只与97000的条带发生特异性ige结合，而有5例那么显示与3800041000的单条蛋白带反响。leung等3报道，分子量为34000的蛋白是蟹中第一个被鉴定的主要变应原。我们鉴定的主要变应原组分是74400和48700的蛋白质；次要变应原组分的分子量为89100、33700和29200。各实验室结果不一致，可能是由于蟹种和人种的差异引起的。由于蟹的种类不同，所以有必要对不同种类的蟹进展深化研究，以得到针对不同种类的标准化的蟹变应原制剂。蟹是引起过敏的最常见的海产品之一，目前国内临床上进展体内外变应原检测所用的变应原只是经脱脂后的粗浸液，其内含有多种蛋白组分，其中包括主要、次要变应原组分和其他非特异性蛋白成分，由于未进展纯化和标准化，批间差异大，影响临床诊断的准确性，甚至发生严重的不良反响，因此我国目前迫切需要研制出具有本国及本地区特色的标准化蟹变应原，以进步体内和体外检测诊断的准确性和平安性。梭子蟹的