一氧化氮―一氧化氮合酶系统与骨折愈合

1、一氧化氮一氧化氮合酶系统与骨折愈合【关键词】一氧化氮一氧化氮(nitrixide，N)是在一氧化氮合酶(nitrixidesythase,NS)作用下氧化产生的一种小分子自由基气体。由于其分子量小，脂溶性及化学性质活泼，因此极易透过生物膜，是细胞间、细胞内的重要信使分子。由于其合成易于调节，作为高级生物体，调节的有效信号在循环、呼吸、消化及内分泌代谢等系统中发挥着重要作用。近几年来的研究发现，NNS系统对骨折愈合起重要作用。本文就NNS系统对骨折愈合的影响作一综述。1N在骨组织中的合成N由L精氨酸(LArginine)氧化途径产生，限速酶是NS。目前已证实骨组织中存在全部3个NS亚型1。神经元

2、型(nNS，NS1)是a2+钙调蛋白(aP)依赖的，主要存在于神经元和某些上皮细胞。但破骨细胞(stelast，)和成骨细胞(steblast，B)体外培养中未发现，可能其来自于分布于骨组织内血管中膜的神经组织。诱生型(iNS，NS2)不依赖a2+aP可被细菌脂多糖(LPS)和或肿瘤坏死因子(TNF)、IL1等诱导表达，主要存在于巨噬细胞、星形胶质细胞、中性粒细胞、内皮细胞等。内皮型(eNS,NS3)也是a2aP依赖型，多见于内皮细胞。和破骨前体细胞(stelastprgenitr)、B和骨细胞(steyte)均既能表达eNS，又能表达iNS。在骨的微环境中，许多细胞可以产生N，如和成骨细胞(

3、steeyte)。但对N在骨的合成部位却理解不多。有学者用免疫组化方法降低尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶(NADPHd)技术来确定N在骨的活性部位。Shidt2认为，NADPHd活性存在于鼠长骨内，但这些细胞不能与NS特异抗体结合。也有人证实，活体NADPHd活性存在于,但不清楚这种活性是否来自NS。免疫学定位研究说明，eNS或NS存在于新别离培养的大鼠和用LPS培养的大鼠长骨中。免疫组化和原位杂交研究证明，骨髓巨噬细胞是iNS活性最主要的来源。2NS在骨折愈合过程中的表达及定位不同类型的NS在骨折愈合的不同时期，它们表达的强弱也有所不同。人和大鼠骨折过程中均发现了3种NS的存在，而在非骨折

4、的股骨皮质中未发现三种NSRNA的表达不同及酶的活性。在骨折愈合过程中，3种NS异构体表达分布不一样，即表现为时间相关性、细胞分布差异性。rbett等应用免疫组织化学、蛋白印迹(esternblts)、L瓜氨酸酶法证实：在骨折愈合早期，皮质骨血管和骨细胞强烈表达eNS骨折后1d酶可观察到活性；iNS在骨内膜成骨细胞和成软骨细胞内表达程度下降(尤其是骨折后第2周)；骨折端那么没有nNS的表达。eNS的增高和iNS的下降在骨折愈合早期是非常重要的，两者均可促进骨折愈合。Zhu等4通过半定量竞争性PR发现，在大鼠股骨骨折后第4d，3种类型的NSRNA的表达都增加。iNS在骨折后4、7d表达最多，主要

5、分布于骨膜骨痂和皮质骨外表的细胞内，骨折后14d骨痂中iNS下降到不可检测的程度；eNS在骨折后7、14d表达最多，主要分布于软骨区和血管周围的细胞内；nNS在骨折后14、21d表达最多，主要分布于纤维软骨区内纤维组织和骨痂间的区域。并推测在骨折愈合的不同时期应用不同的NS抑制剂或刺激剂可以调节骨折的修复。尽管不同学者研究的结果有所不同，但结论共同点为3种类型的NS在骨折愈合的不同时期表达具有类型特异性和理论依赖性。而iNS和eNS间互相制约：iNS的增加伴随着eNS的减少，或者eNS的增加伴着iNS的减少。3NNS系统在骨折愈合中的生物学作用31调节骨折部位的血管反响。充足的血流供给、适当的

6、血管反响对骨折的愈合起着关键作用。骨折后的最初30in内部分血流量减少，24h后恢复正常，而3d后血流量增加了3倍。血流增多可能是由于部分血管的舒张和新生血管的生成。N在各种病理生理情况下可能是最有效的血管扩张剂和血管形成的介质。它在乙酞胆碱的作用下由内皮细胞合成和释放，通过松弛附近平滑肌而使血管扩张。rbett等5发现，在骨折修复过程中，N对血管构造具有功能性的时间依赖性效应。骨折愈合早期，特别是在骨折后第1dN依赖性血管反响最强，并且局限于骨折部位。长骨骨折早期，骨折断端的血流是降低的，在N作用下，血流在几小时内将恢复，并且随骨折愈合进程显著增加。N主要通过增加血管平滑肌内GP程度，使骨折

7、部位的血管扩张，从而使骨折端血流增加，促进骨折愈合。同时，N可调节骨髓的血液供给，加速生成血细胞，增加循环血流量。由此推测，eNS的表达可增加些流量，改善部分微循环，从而增强骨痂的生物力学性能。32调节碱性磷酸酶的活性碱性磷酸酶(alkalinephsphatase，ALP)的活性反映了成骨细胞的成骨活性。ALP是成骨细胞分化的早期指标，其作用是水解有机磷酸释放无机磷，用于羟基磷灰石的形成，因此是骨形成的特异性酶。Nakungatthai等6对大鼠股骨骨折后第4、7、14、28d的骨痂组织块培养发现，骨折后第7d的骨痂组织块ALP的活性最高，而骨折后第14d的骨痂组织块ALP的活性最低。在培养

8、液中用NS抑制剂S(2ainethyl)isthiurniubridehydride与骨痂组织块共同孵化，上述4个时间点的骨痂组织块的ALP活性均下降50，而低剂量(025lL)补充N供体3rphlinsydnninehydrhlride(SIN1)那么可使ALP活性增加20。ALPRNA和ALP被发现定位在骨痂内成骨细胞样细胞和软骨细胞样细胞内。33NNS系统对的影响是骨中N的来源之一，通过辅酶黄递酶染色，呈强阳性，证实了自身可生成N。目前认为N对的作用主要涉及以下环节：331使胞浆收缩，降低外表积，改变形状，抑制在骨基质上粘附和质子泵分泌H+功能，并直接抑制粘附机制，特别是整合素(inte

9、grin)、表达，引起脱离吸收部位，类似降钙素的R效应(retratinatin)。但并不影响细胞膜的运动，这是与降钙素作用的不同点。332抑制破骨细胞前体增殖进而抑制形成。在别离的鼠培养基中参加高浓度可溶性N气体(30lL1)和N生成剂硝普盐(001lL1)可抑制骨吸收。001lL的硝普盐还可抑制甲状旁腺(PTH)刺激骨吸收。虽然N在骨的产生与细胞内的GP蓄积有关，但GP的类似物可能对骨吸收没有直接作用。根底浓度的N是维持正常骨吸收功能所必需，适当低浓度N可促进破骨细胞前体向转化。低浓度N还可增强IL1、TNF诱导的性骨吸收，如IL1、TNF结合作用产生的低浓度N，对骨吸收有显著刺激作用；低

10、浓度的N供体S亚硝基乙酰青酶胺(SNAP)可增强IL1诱导的骨吸收。在炎症条件下激活的T淋巴细胞可产生干扰素(IFN)，而IFN可诱导N的产生，抑制由IL1与肿瘤坏死因子(TNF)引起的骨吸收并伴有数目减少；风湿性关节炎患者的IFN低于对照组。精氨酸的类似物硝基L精氨酸甲酯(LNA)可完全阻断N的产生。这些资料说明，高浓度的N不仅抑制成熟的骨吸收而且还可抑制的产生。由此可见，N对骨的吸收有双重调节作用即：高浓度N经抑制形成和抑制成熟的吸收功能而抑制骨吸收；而低浓度N那么增强细胞素诱导的骨吸收，并且对正常的功能来说是必不可少的7。转贴于论文联盟.ll.34NNS系统对B的影响最近的研究说明，B是

11、骨组织中N的又一重要来源。自然状态下测定培养中的正常人松质骨来源的B，发现其几乎不产生N。目前认为即使有N产生，其根底程度也较低8。炎性疾病时可激活iNS途径以增加N产量，说明细胞因子诱导增加N的产生是通过激活iNS的合成。关于N对其靶细胞的作用机制目前尚不完全清楚，归纳起来有如下途径：341N可与靶细胞内鸟苷酸还化酶结合，进步该酶活性，增加细胞内环磷酸鸟苷(GP)含量，以GP为第2信使发挥其生物学作用。但GP类似物二丁基GP和8溴GP对N靶细胞无N样作用不支持此观点。342由于N可使形态发生变化，所以有学者提出N作用机理可能通过某些蛋白激酶或某些功能蛋白影响细胞骨架而起作用。有研究显示：N对

12、B的影响存在一个阈值问题，中等量的N似乎对维持B的生长非常必要。当N的合成超出阈值时，N对B有抑制作用，甚至毒性作用。NS竞争性抑制剂LNA可抑制人或鼠B增生，并呈剂量依赖性。在培养液中增加L精氨酸的浓度或补充N供体可阻止这种效应。eNS在Rs1728细胞、G63细胞和人原始成骨细胞中表达。这些资料显示，适当剂量的N对调节B的生长有重要作用。高浓度N还可抑制前B内3H胸腺嘧啶(3HTdR)摄入量9，抑制前成骨细胞增殖，影响B的形成。此外，较高浓度的N可促进B凋亡，通过环氧酶(X)旁路抑制B碱性磷酸酶(ALP)活性并阻断前列腺素(PG)对B的作用，并抑制B合成反映其活性的标记物骨钙素(BGP)，

13、从而抑制骨质矿化。35NNS系统对软骨细胞的影响正常情况下，软骨细胞几乎不产生N，且正常软骨细胞中亦无iNS分布，而用IL1、肿瘤坏死因子(TNF)等激活后，iNS分布明显增加，iNS选择性抑制剂作用于骨关节炎软骨，N的产生明显减少。软骨细胞需在IL1等细胞因子的诱导下通过iNS催化产生N。N对软骨细胞功能的调节：(1)抑制软骨细胞增殖：其作用机制可能有：可能通过GP增加，抑制DNA合成，从而抑制软骨细胞增殖10；N可能促进前列腺素(PGE2)的产生，通过PGE2抑制软骨细胞增殖；N可能促进碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的合成释放，通过bFGF抑制软骨细胞的增殖；(2)抑制软骨细胞的迁移、

14、粘附：软骨细胞的迁移、粘附对软骨的生长、发育有重要作用，IL1等细胞因子激活软骨细胞产生的N抑制软骨细胞的迁移，也抑制软骨细胞粘附到纤粘连蛋白(Fn)上，从而削弱软骨的修复才能11；(3)诱导软骨细胞凋亡：N供体在体外可诱导软骨细胞凋亡，IL1和氧自由基去除剂一同作用于软骨细胞可引起细胞凋亡，在N产生减少的情况下，氧自由基引起软骨细胞死亡，不是氧自由基而是N引起软骨细胞凋亡；(4)引起或促进软骨细胞死亡：H22参加到IL1TNF处理和未处理的软骨细胞中，前者的LD50仅是后者的非常之一，且增加的酶感性可被NS抑制剂彻底消除，N可能通过减弱软骨细胞的去氧化剂的毒性作用直接引起或间接促进软骨细胞死

15、亡；(5)干扰软骨细胞内、外信息的传递：N供体或炎性细胞因子可阻断Fn和粘合素51(Fn的受体)结合后引起的软骨细胞内一系列的激活与G蛋白相似的ras蛋白的合成、蛋白质的磷酸化等，却既不影响软骨细胞和Fn的结合，也不影响粘合素51在细胞周围的聚集，可见N干扰了软骨细胞外信息向细胞内传递，从而影响软骨细胞的功能。4N供体促进骨折愈合的应用Baldik等12运用iNS基因治疗iNS缺陷大鼠来评价iNS对骨折愈合的作用。iNS基因缺陷大鼠骨折的股骨总能量吸收值和最大能量吸收值分别较野生型大鼠下降30和70。经iNSDNA治疗后可改善以上情况，并与改变强度相比显著增加达20。rbett等5亦证明，胫骨

16、骨折和正常大鼠口服LNAE28d后，骨折端矿物质含量和机械强度均较对照组明显降低，说明N在骨折愈合过程中起重要的调节作用，并且N参与了正常骨矿物质含量的调节。运用赖氨酸和L精氨酸，可促进成骨细胞释放N，并增加I型胶原表达13。Baldik等14将36只成年SD雄鼠分为三组，与右侧股骨中段造成5骨缺损。经坚强内固定后，部分给予N供体亚硝基牛血清白蛋白和口服选择性iNS抑制剂氨基胍后，应用放射学和组织学观察骨的形成和愈合情况，发现实验组均比对照组明显促进骨的愈合。推测结合应用N供体可在临床上促进骨折愈合。Jaal等15对317名英国女性骨质疏松症患者每天使用根底剂量的NG以及另外74名同性质的骨质

17、疏松症患者周期性应用2a硝酸甘油后，与未用药组相比，每日用药组足跟BD无明显增加，髋部BD增加了13；而周期性用药组足跟BD增加了53，髋部BD增加了26，同时骨折率下降。说明无论何种用药方法，硝酸盐均增加了BD，而周期性使用增加较显著。参考文献：1aballerAliasA,LveridgeN,LynA,etal.NSisfrsinadulthuansteytes:ultiplepathaysfNregulatinJ.alifTissueInt,2022,75(1):78-84.2ShidtHH,GagneGD,Nakane,etal.appingfneuralnitrixidesythas

18、eintheratsuggestsfrequentlalizatinithNADPHdiaphrasebutntithslubleguanylylylase,andnvelpaneuralfuntinsfrnitrinergisignaltusdutinJ.JHistheythe,1992,40(10):1439-1456.3rbettSA,Hukkanen,BattenJ,etal.Nitrixideinfraturerepair.Differentiallalisatin,expressinandativityfnitrixidesynthasesJ.JBneJintSurgBr,1999

19、,81(3):531-537.4Zhu,DianAD,LinJH,etal.NitrixidesynthaseisfrsduringfraturehealingJ.JBneinerRes,2001,16(3):535-540.5rbettSA,arthyID,BattenJ,etal.NitrixideediatedvasreativityduringfraturerepairJ.linrthpRelatRes,1999,(365):247-253.6NakungatthaiH,DianA,asnRS,etal.Nitrixideregulatesalkalinephsphataseativi

20、tyinratfratureallusexplantulturesJ.RedxRep,2000,5(2-3):126-127.7Hukkanen,PlattsLA,LaesT,etal.Effetfnitrixidednrnitrglyerinnbne.ineraldensityinaratdelfestrgendefiienyinduedstepeniaJ.Bne,2022,32(2):142-149.8vantHfRJ,RalstnSH.NitrixideandbneJ.Iunlgy,2001,103:255-261.9Fini,TrrielliP,GiavaresiG,etal.EffetfLlysineandLargininenpriarysteblastulturesfrnralandstepeniratsJ.BiedPharather,2001,55(4):213-220.10StuderRK,DekerK,elheS,etal.Nitrixidei