婴幼儿食品和乳品中乳清蛋白的测定（食品安全国家标准）

1、PAGE 13GB/T 2012 PAGE I食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中乳清蛋白的测定范围本标准第一法规定了应用高效液相色谱质谱联用法测定乳清蛋白。 本标准第一法适用于除水解或酶解乳蛋白配方外的婴幼儿配方食品、乳粉和乳中的非变性和热变性的牛乳清蛋白的含量测定；本标准第二法适用于纯牛乳基婴幼儿配方乳品中乳清蛋白的测定。第一法 高效液相色谱质谱联用法原理试样加入水后涡旋或超声溶解，冷却至室温并定容，精确吸取一定量，并加入同位素内标，用二硫苏糖醇（DTT）将蛋白质分子中或间的二硫键打开，用碘代乙酰胺保护，加入过量的碱性胰蛋白酶，在37下经酶解，选择牛-乳白蛋白、-乳球蛋白的特异性肽段，经反相

2、色谱分离，电喷雾离子源离子化，多反应离子监测（MRM）方式检测，同位素内标法定量。试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 碳酸氢铵（NH4HCO3）。3.1.2 二硫苏糖醇（DTT）。3.1.3 碘代乙酰胺（IAA）。3.1.4 氯化钙（CaCl2）。3.1.5 乙酸。3.1.6 甲酸：色谱纯。3.1.7 乙腈：色谱纯。3.1.8 牛胰蛋白酶3.2 试剂配制3.2.1 碳酸氢铵溶液：称取3.95 g 碳酸氢铵固体，用水溶解并稀释至100 mL；3.2.2 DTT溶液:称取0.771 g DTT固体，用碳酸氢铵溶液溶解定容

3、至10 mL；3.2.3 IAA溶液：称取0.925 g IAA固体，用碳酸氢铵溶液溶解定容至10 mL；3.2.4 CaCl2溶液：称取0.111 g CaCl2固体，用水溶解并稀释至10 mL；3.2.5 乙酸溶液：移取0.1 mL乙酸，用水稀释至10 mL；3.2.6 牛胰蛋白酶溶液：称取5 mg牛胰蛋白酶，用乙酸溶液溶解并定至10 mL；3.2.7 0.1% 甲酸的水溶液：准确移取1.0 mL甲酸，加入超纯水并定容至1000 mL；3.2.8 0.1% 甲酸的乙腈溶液：准确移取1.0 mL甲酸，加入乙腈并定容至1000 mL；3.3 标准品3.3.1 牛-乳白蛋白特异肽段标准固体牛-乳

4、白蛋白特异肽段标准固体，纯度不低于99.9 %；3.3.2 牛-乳白蛋白同位素标记特异肽段固体 牛-乳白蛋白同位素标记特异肽段固体，纯度不低于98%；3.3.3 牛-乳白蛋白同位素标记内标固体牛-乳白蛋白同位素标记内标固体，纯度不低于98%；3.3.4 牛-乳球蛋白特异肽段标准固体 牛-乳球蛋白特异肽段标准固体，纯度不低于99.9 %；3.3.5 牛-乳球蛋白同位素标记特异肽段固体 牛-乳球蛋白同位素标记特异肽段固体，纯度不低于98%；3.3.6 牛-乳球蛋白同位素标记内标固体牛-乳球蛋白同位素标记内标固体，纯度不低于98%；3.4 标准溶液配制3.4.1 -乳白蛋白特异肽段标准储备溶液：称取

5、牛-乳白蛋白特异肽段粉末6.00 mg（准确至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成500 mol/L的储备溶液。将溶液转移到塑料瓶中，置于- 20电冰箱内保存。3.4.2 -乳白蛋白同位素标记特异肽段储备溶液：称取牛-乳白蛋白同位素特异肽段粉末 6.6 mg（准确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成500 mol/L的储备溶液。将溶液转移到塑料瓶中，置于- 20电冰箱内保存。3.4.3 -乳白蛋白同位素标记内标储备溶液：称取牛乳-乳白蛋白同位素内标粉末14.4 mg（准确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成500 mol/L的储备溶液。将溶

6、液转移到塑料瓶中，置于- 20电冰箱内保存。3.4.4 -乳球蛋白特异肽段标准储备溶液：称取牛-乳球蛋白特异肽段粉末4.6mg（准确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成500 mol/L的储备溶液。将溶液转移到塑料瓶中，置于- 20电冰箱内保存。3.4.5 -乳球蛋白同位素标记特异肽段储备溶液：称取牛-乳球蛋白同位素特异肽段粉末4.7 mg（准确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成500 mol/L的储备溶液。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20电冰箱内保存。3.4.6 -乳球蛋白同位素内标储备溶液：称取牛-乳球蛋白同位素内标粉末16.7 mg（准确至0.1 m

7、g）于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成500 mol/L的储备溶液。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20电冰箱内保存。3.4.7 特异肽段标准中间混合溶液：分别准确移取200 L牛-乳白蛋白、-乳球蛋白特异肽段标准储备液于10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，获浓度为10 mol/L的标准中间溶液。 3.4.8 同位素标记特异肽段中间混合溶液：分别准确移取40 L牛-乳白蛋白、-乳球蛋白同位素标记特异肽段储备液于10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，获浓度为2 mol/L的标准中间溶液。3.4.9同位素内标中间混合溶液：分别准确移取40 L牛-乳白蛋白、-乳球蛋白同位素内标储备液于10 mL容量瓶

8、中，加水稀释至刻度，获浓度为2 mol/L的标准中间溶液。4 仪器和设备4.1 液相色谱-质谱联用仪：带电喷雾离子源；质量数范围，12000质荷比（m/z）；分辨率，0.1原子质量单位（AMU）。4.2 色谱柱：硅烷基 C18柱，柱长100 mm，柱内径2.1 mm；填料粒径1.7 m，孔径30 nm（300 ）或相当者。注：市场购入的色谱柱，将孔径30 nm 标识为300 。4.3 天平：感量0.01 g；0.0001 g。4.4 涡旋混合器：振荡转速不低于2400 转/分钟。4.5 超声波振荡器。4.6 恒温水浴摇床。4.7 微量移液器：1 L 10 L、10 L 100 L、100 L

9、1000 L。4.8 具塞试管：10 mL。4.9 0.22 m微孔滤膜。4.10 5mL一次性注射器。5 分析步骤5.1试样制备称取固体试样约2 g或液体试样约10 g（精确至0.01g，内含蛋白质200 mg左右）于100 mL容量瓶中，用90 mL水将试样充分溶解，置于涡旋混合器或超声波振荡器中短时溶解，并用水定容至刻度。混匀后准确移取1.0 mL上述试样定容至10 mL，再次混匀后准确移取200 L试样于2 mL离心管中，加入50 L同位素内标中间溶液、150 L碳酸氢铵溶液、10 L DTT溶液，混匀后置75 下恒温水浴30 min；冷却至室温，加入30 L IAA溶液，暗处静置30

10、 min；再加入10 L CaCl2溶液、50 L牛胰蛋白酶溶液，充分混匀后置于37恒温水浴中酶解5小时。用10 L甲酸终止酶解，室温下静置15 min，加入490 L水，涡旋混匀，用0.22 m滤膜过滤，供液相色谱串联质谱仪检测。5.2 仪器参考条件5.2.1 液相色谱参考条件5.2.1.1 流动相A：0.1%甲酸水溶液；动相B：0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱：按表1给出的条件洗脱。表1 梯度洗脱条件（色谱分离）时间min流动相A流动相B梯度变化曲线095%5%00.895%5%11.290%10%62.583%17%62.677%23%63.877%23%14.00%100%64.80%1

11、00%15.095%5%65.2.1.2 流动相流动速度：0.3 mL/min。5.2.1.3 色谱柱柱温：40 。5.2.1.4 试液温度：10 。5.2.1.5 进样体积：5 L。5.2.2 质谱参考条件5.2.2.1 仪器控制条件：毛细管电压：3.5 kv，锥孔电压：35 kv，脱溶剂温度：500 ，脱溶剂气流量：800 L/min，锥孔反吹气流量：30 L/hr，碰撞室压力：3.010-3 mbar；低端分辨率1：2.5 V，高端分辨率1：15.0 V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8 V，高端分辨率2：15.0 V，离子能量2：1.0；离子源温度：150，提取器电压：3.0

12、V，入口透镜电压：0.5 V，出口电压：0.5 V，碰撞梯度：1.0。5.2.2.2 质谱检测条件：表2 MRM的质谱参数化合物名 称母离子（m/z）子离子m/z碰撞能量eVM+2H 2+-乳白蛋白特异肽段601.1284.37*28355.3724-乳白蛋白同位素特异肽段608.1284.34*26355.3524-乳球蛋白特异肽段458.8616.622503.8*27-乳球蛋白同位素特异肽段465.8623.622503.8*27*为定量离子5.3 标准曲线的制作使用微量移液器吸取特异肽段标准中间混合溶液分别配制浓度为0 nmol/L、5 nmol/L、25 nmol/L、75 nmol

13、/L、150 nmol/L、300 nmol/L和500 nmol/L的标准系列工作溶液，每个浓度点加入50 L的同位素内标肽段。以标准系列溶液的浓度为横坐标，对应各浓度点中特异肽段与内标肽段的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线图；或计算回归方程式。牛-乳白蛋白、-乳球蛋白特异肽段及其内标肽段标准品的色谱质谱图见附录A的图A.1。5.4 试液的测定按照5.2.2.1 和 5.2.2.2确立的条件，测定试样和标准系列溶液，根据峰面积比值，内标法定量试样中的牛-乳白蛋白和-乳球蛋白特异肽段的浓度，试样中牛-乳白蛋白和-乳球蛋白特异肽段及其内标肽段的色谱质谱图见附录A的图A.1。平行测定次数不少于两次

14、。5.5 空白试验不称取试样，按5.1的步骤做空白，确认不含有干扰待测组分的物质。5.5 总蛋白测定 样品中总蛋白的测定：在催化加热条件下使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生产硫酸铵。碱化蒸馏时氨游离被硼酸吸收，用硫酸或盐酸滴定，根据酸的消耗体积乘以换算系数计算，即为蛋白质含量。6 结果计算6.1 乳清蛋白结果计算试样中牛-乳白蛋白及-乳球蛋白的含量由公式（1）计算得。 （1）式中：Cx样品中牛乳-乳白蛋白的浓度，单位为克每百克（g/100g）； M牛-乳白蛋白的分子量14178，牛-乳球蛋白的分子量18320；N样品稀释倍数。nx溶液中牛-乳白蛋白、-乳球蛋白特异肽段的物质的量的浓度，单位为纳

15、摩每升（nmol/L）。6.2 乳清蛋白含量的计算试样中乳清蛋白的含量由公式（2）计算得。 （2）式中：Cw试样中乳清蛋白的含量，单位为克每百克（g/100g）；C试样中牛-乳白蛋白的含量，单位为克每百克（g/100g）；C试样中牛-乳白蛋白的含量，单位为克每百克（g/100g）；F折算系数，取值4/3。6.3 总蛋白结果计算.（3）Cc试样中总蛋白的含量，单位为克每百克（g/100g）；V1试样消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；V0试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；V3吸取消化液的体积，单位为毫升（mL）；c 硫酸或盐酸标准溶液浓度，单位为摩尔每升（m

16、ol/L）；0.01401.0mL硫酸或盐酸标准溶液（1.000mol/L）相当的氮含量，单位为克（g）；F 氮换算蛋白质的系数。6.4 乳清蛋白比率的计算试样中乳清蛋白占总蛋白的比率由公式（3）计算得。 （4）式中：X试样中乳清蛋白占总蛋白的比率，%；Cw试样中乳清蛋白的含量，单位为克每百克（g/100g）；CC试样中总蛋白的含量，单位为克每百克（g/100g）。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测XX果的算术平均值表示，结果保留小数点后三位。7 精密度在重复性条件下，获得的两次独立测XX果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。 8 其它本标准第一法牛-乳白蛋白的定量限为0.020 g/

17、100g，牛-乳球蛋白的定量限为0.025 g/100g。第二法 氨基酸临界值判定法8 原理样品经氧化水解过滤后，滤液经衍生剂衍生，衍生物经液相色谱仪分离、紫外检测器检测，分别测定出五种氨基酸（胱氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸）的含量。根据乳清蛋白占乳蛋白60%时所对应的上述氨基酸的临界值，综合判定乳清蛋白占乳蛋白的含量是否达到60%。9 试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水9.1 试剂9.1.1 甲酸铵：优级纯。9.1.2 过氧化氢。 9.1.3 甲酸。9.1.4 氢溴酸（GB621）。9.1.5 盐酸。9.1.6 氢氧化钠。9.

18、1.7 四硼酸钠。9.1.8 甲酸：色谱纯。9.1.9 乙腈：色谱纯。9.1.10 N-羟基琥珀酰亚胺-活性杂环氨基甲酸酯（AQC）或功能相近的其它衍生剂9.2 试剂配制9.2.1 过甲酸溶液：将30%过氧化氢与88%甲酸按1:9混合，于室温下放置1h后，置冰水浴中冷却30 min，临用前配制。9.2.2 盐酸溶液（6.0 mol/L）:盐酸与水按1:1混合。9.2.3 盐酸溶液（1.0mol/L）：90mL盐酸定容至1000mL。9.2.4 盐酸溶液（0.1mol/L）：9mL盐酸定容至1000mL。9.2.5 氢氧化钠溶液（1.0mol/L）：40g氢氧化钠溶解定容至1000mL。9.2.

19、6 氢氧化钠溶液（0.1mol/L）：4g氢氧化钠溶解定容至1000mL。9.2.7 样品缓冲溶液（硼酸钠-硼酸缓冲液）：5%四硼酸钠+95%的水，调pH=8.8。9.2.8 参考衍生剂：准确称取10 mg的N-羟基琥珀酰亚胺-活性杂环氨基甲酸酯（AQC）或功能相近的其它衍生剂用1 mL乙腈溶解。9.2.9 流动相A：准确称取甲酸铵3.153 g，用水定容到1000 mL，用甲酸调pH=5.00，此溶液为50 mmol/L。9.2.10 流动相B：乙腈。9.2.11 流动相C：超纯水。9.3 标准品9.3.1 磺基丙氨酸（简称Cya）磺基丙氨酸，纯度99%。9.3.2 天冬氨酸（简称ASP）天

20、冬氨酸，纯度99%。9.3.3 丙氨酸（简称ALA）丙氨酸，纯度99%。9.3.4 脯氨酸（简称PRO） 脯氨酸，纯度99%。9.3.5 苯丙氨酸（简称PHE）苯丙氨酸，纯度99%。9.4 标准溶液配制9.4.1 标准贮备溶液：分别准确称取氨基酸标准品磺基丙氨酸0.0846 g，天冬氨酸0.066 g，丙氨酸0.0446 g，脯氨酸0.0576 g，苯丙氨酸0.0826 g（精确至0.0001 g），用0.1 mol/L盐酸溶解并定容于50 mL容量瓶中，各标准贮备溶液为10.0 mol/mL。9.4.2 混合标准工作液：分别依次吸取上述标准贮备液0.5 mL 、1.0 mL、5.0 mL、1

21、0.0 mL、20.0 mL于100 mL容量瓶中，用超纯水稀释并定容至刻度，配置成浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 （mol/mL）混合标准工作液。10 仪器和设备10.1 超高效液相色谱仪或高效液相色谱仪，带紫外检测器。10.2 天平：感量为0.1 mg。10.3 pH计：精度为0.01。10.4 涡旋混合器。10.5 氮吹仪。10.6 培养箱。10.7 恒温干燥箱。10.8 减压蒸馏装置。10.9 超声波振荡器11 分析步骤11.1 试样的制备11.1.1 氨基酸试样制备11.1.1.1 称样和氧化称取混合均匀的含蛋白质7.5 mg -25 mg的样品（精确至0.0

22、001 g）于水解管中，在冰水浴中冷却30 min后加入2 mL已经冷却的过甲酸溶液，盖好瓶塞后置于0 1 冰箱中，冰浴16 h。向各水解管中加入0.3 mL氢溴酸，振摇后冰浴30 min，在60 2 氮吹仪上浓缩至干或在60 2 下减压蒸馏至干。11.1.1.2 水解向水解管内加入6 mol/L盐酸8 mL15 mL，充入氮气1min后，拧紧螺丝盖，将水解管放在1101的恒温干燥箱内水解24 h后取出冷却至室温。将水解液用超纯水转移并定容至25 mL容量瓶中，混匀，滤纸过滤。吸取滤液1 mL于指型瓶中，在60 2 氮吹仪上浓缩至干或在低于50 下减压蒸馏至干。残留物用1 mL超纯水溶解，即为

23、试样溶液。11.1.2 游离氨基酸试样制备准确称取混合均匀的样品约2.5 g（精确至0.0001 g）于100 mL锥形瓶中，加入约25 mL45 50 温水溶解。降至室温后用盐酸溶液调节样品溶液的pH值至1.70.1，放置约1 min；再用氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值至4.50.1，超声振荡约10 min，用水转移并定容至50 mL容量瓶中混匀。滤纸过滤后经0.22 m滤膜过滤，滤液即为试样溶液。11.2 参考色谱条件：色谱柱：UPLC BEH C18色谱柱，2.1100 mm，1.7 m或其它性能相近的色谱柱 流速：0.6 mL/min进样体积：1 L紫外检测器：波长248 nm柱温：

24、60 样品室温度：10 参考衍生条件：分别取试样溶液及混合标准工作液各10 L，各加入70 L样品缓冲液，振荡混匀。边振荡边加入20 L衍生剂，振荡后于55 1 培养箱中放置10 min，即得标准工作衍生液及样品待测液。表1 四元泵梯度洗脱表时间（min）流速（mL /min）%A%B%C%D曲线10.610000020.300.699.50.5001133.500.696.53.500545.000.694.55.500755.700.692.08.000466.200.692.08.000777.740.678.821.200688.500.6059.640.401199.000.6059

25、.640.4061011.000.6100010001表2 二元泵梯度洗脱表时间（min）流速（mL /min）%A%B曲线10.6100020.220.699.50.51133.420.696.53.5544.920.694.55.5755.620.692.08.0466.120.692.08.0777.660.678.821.2688.420.640601199.000.6100061011.000.61000111.3 标准曲线的制作将标准工作液衍生液分别注入到超高效液相色谱仪中得到标准工作液的峰面积（或峰高），以标准工作液的峰面积（或峰高）为纵坐标，以标准工作液浓度（mol/mL）为横

26、坐标绘制标准曲线。标准溶液色谱图见附录B中图B1。11.4 样品溶液的测定将样品待测液注入到超高效液相色谱仪中得到峰面积（或峰高），根据标准曲线得到样品待测液的浓度（mol/mL）。11.5 总蛋白的测定样品中总蛋白的测定：在催化加热条件下使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生产硫酸铵。碱化蒸馏时氨游离被硼酸吸收，用硫酸或盐酸滴定，根据酸的消耗体积乘以换算系数计算，即为蛋白质含量。11.6 非蛋白氮的测定样品中非蛋白氮的测定：用15%的三氯乙酸溶液沉淀蛋白质，滤液经消化，蒸馏后，用0.01mol/L盐酸滴定，计算氮含量，即为样品中非蛋白氮含量。12 分析结果的表述 12.1 氨基酸的计算样品中各氨

27、基酸占乳蛋白的含量按下列公式计算： ，（1） .，（2） .（3） .（4） .（5）式中：X样品中氨基酸的含量，单位为克每百克蛋白质（g/100g蛋白质）。X1样品中总氨基酸的含量，单位为克每百克蛋白质（g/100g蛋白质）。X2样品中游离氨基酸的含量，单位为克每百克蛋白质（g/100g蛋白质）。C1从标准曲线中获得试样总氨基酸测定液的浓度，单位为微摩每毫升（mol/mL）。C2从标准曲线中获得游离氨基酸测定液的浓度，单位为微摩每毫升（mol/mL）。 m1称取的测定水解氨基酸样品的质量，单位为克（g）。m2称取的测定游离氨基酸的样品的质量，单位为克（g）。 MAA各氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol）。Vi测定水解氨基酸样品的体积，单位