分子标记介绍

1、分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。即DNA片段即能反映生物个体或种 群间基因组中某种差异特征的DNA片段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或 群体的遗传特征，并可被用作遗传分析的物质。它能够直接反映基因组间DNA间的差异。常 用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分 子标记；RFLP属于以Southern为基础的分子标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分子 标记；EST以mRNA为基础的分子标记。1 主要的分子标记介绍1.1限制性片段长度多态性（RFLP）RFLP是应用Sou thern杂

2、交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大 小。所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA片段的缺失、插入、倒位而引起 酶切位点缺失或获得等均可应用。此方法的基本步骤包括：DNA的提取、用限制性内切酶酶 切DNA、凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定 的DNA片段、分析结果。探针一般选择单拷贝的。其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗 时，昂贵且需应用同位素。用该技术可作出植物的RFLP图谱，并应用于植物遗传和育种研 究。杨长红等采用PCR-RFLP技术，对库尔勒香梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进行 研究，其利用10

3、对通用引物对总DNA进行扩增，并且采用7种限制性内切酶对PCR产物进行酶 切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨 属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09/MvaI, cp03/Hin6I的酶切位点有显著差异。根据结 果分析，库尔勒香梨与鸭梨、砀山梨、苹果梨、早酥、慈梨、金川雪梨、锦丰、新疆句句梨 的平均距离系数较小，与其他梨的平均距离系数较大。1.2随机扩增多态性DNA（RAPD）RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利用PCR技术非特异性扩增DNA片段， 然后用凝胶电泳分开扩增片段，即得到一系列多态性DNA

4、片段.染色后即可进行多态性分析。 其特点包括：无需知道模板的结构信息及无种属特异性；用一个引物就可扩增出许多片段； 不涉及放射自显影及其他技术；所需样品少且成本低；仅为显性遗传且重复性差。其主要应 用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。傅明洋等运用RAPD技术对白杨派中7 个树种和3个人工杂交种共计50个无性系的亲缘关系进行分析共筛选出的26条随机引物共扩 增产生222条谱带,其中200条为多态性谱带,多态性带达90.09%,且种间遗传变异大于种内无 性系间的遗传变异。聚类分析结果显示,参试的50个材料可分为2大类：第一类由山杨、小叶 杨、河北杨组成;第二类由毛白杨、银毛杨、84K杨

5、、银白杨、银灰杨、新疆杨和银新杨组成;3 个人工杂交种与白杨亚派树种的亲缘关系较近;人工杂交种银毛杨与84K杨间亲缘关系最近。 1.3扩增片段长度多态性（AFLP）AFLP将PCR与RFLP相结合，将植物基因组DNA经2个限制性内切酶酶切后，与特定接头相 连接，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行特异性PCR扩增，最后分离扩增的 DNA片断，可用放射性法、荧光法或银染染色法检测。其操作步骤为：DNA提取和质量检测； 双酶切和酶切片段连接；酶切连接片段的预扩增；选择性扩增；扩增产物在聚丙 烯酰胺变性凝胶上电泳；将电泳后的凝胶进行显影检测及数据分析。魏朔南等应用植物形 态学和AFLP分子标

6、记，对陕西8个漆树栽培品种和6个野生居群进行了鉴别。从26个形态性状 中筛选出3个主成分，其中：第1主成分指标7个（第5小叶长/宽、花瓣长、花瓣宽、花丝长、 花丝直径、花药长和宽）贡献率为30. 383Vo；第2主成分指标5个（小叶数、复叶长、复叶柄 长、第5小叶叶柄长、顶端小叶叶柄长）贡献率为19321 ；第3主成分指标2个（第5小叶顶 角角度、顶端小叶顶角角度贡献率为13. 777，并且筛选的8对AFLP引物组合（预扩增引物 组合在3端带一个选择性碱基，选择性扩增的引物组合在其3端带3个选择性碱基），均 可将漆树14个样品完全区分开。植物形态学和AFLP分子标记相结合，不仅可用于漆树不同品

7、 种及野生居群间的鉴别，而且可反映其相互间的亲缘关系。1.4单核苷酸多态性(SNPs)SNPs是广泛存在于基因组中的一类DNA序列变异，其频率为1%或更高。它是由单个碱基 的转换或颠换引起的点突变，稳定而可靠，其通常以二等位基因的形式出现，并利用这些差 异，在分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测。近缘种群或同种个体之间的SNPs是存在于 生物基因组上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性。卫尊征等对小叶杨36株基 因型个体的PsGA200 x基因组DNA序列进行比对和分析，检测到49个单核苷酸多态性(SNP)位 点，频率为l/35bp。其中，15个是常见SNPs,34个为罕见SNPs。

8、在这些SNPs中，37个属于转换，12 个属于颠换。在外显子区域，共检测到26个SNP位点，其中23个为同义突变,3个为错义突变。 对PsGA20Ox基因内SNPs进行的连锁不平衡分析表明，随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连 锁不平衡在基因内部就迅速衰退，得出在小叶杨中，基于候选基因的连锁不平衡作图是可行 的，而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的，也是不必要的。1.5简单重复序列(SSR)SSR又称微卫星序列指DNA分子中24个核苷酸串连重复序列分布于整个基因组的不同 位置上，不同品种间其重复长度有高度的变异性，串联重复次数一般为10-50次，同一类微 卫星DNA可分布在基因组的

9、不同位置上，长度一般在100 bp以下，由于重复次数不同，从而 造成了每个位点的多态性。但微卫星DNA两端的序列多是保守的单拷贝序列，根据两端的序 列设计一对特异引物，经PCR扩增，PAGE电泳及放射自显影，可以得到因简单序列重复单位 数不同而引起的扩增片段的多态性，即获知不同个体在这个位点上由于基本单元重复次数不 同而形成的多态性。殷继艳等从新疆额尔齐斯河流域两岸及河谷共收集杨属黑杨派、白杨派 和青杨派等3大组6个种共83份样本单株，首次对新疆额尔齐斯河流域两岸及河谷天然林杨属 种间亲缘关系、银灰杨杂种形成机制、额河杨和新疆杨的分类地位问题，从分子水平进行了 比较系统的研究和分析，表明黑杨派

10、和青杨派的亲缘关系比较近，而白杨派则较远。1.6 表达序列标签( EST)EST是将mRNA反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选 cDNA克隆，对其5 或3 端进行一步测序，所获序列与基因数据库中已知序列进行比较，从 而获得对生物体生长、发育、代谢、繁殖、衰老死亡等一系列生理生化过程。2 应用分子标记可应用在木本植物育种的各个的方面，木本植物的转基因研究成果在提高木本 植物抗性、加速世代交替、抵抗环境污染、维持生态平衡、提供优质木材等方面发挥着越来 越重要的作用。种质资源的遗传多样性分析木本植物个体基因型高度杂合，存在着大量的多态性。由于遗传变异表现在外部形态、 蛋白质分子结构等方面，所以非编码区域的变异对于生物的遗传和进化也起着重要作用，借 助分子标记技术可以较全面地对研究对象进行比较分析，提高分类的准确性和可靠性遗传性状的基因定位研究通常借助个别性状基因(如抗性)的导人对木本植物品种进行改良，所以找寻与目的基因 紧密连锁的分子标记即可实现品种改良的目的。其方法主要有连锁图法(Linkage map)、近 等位基因系法(N