生物制药工艺学基因工程制药课件

1、基因工程制药1医学ppt基因工程制药1医学ppt第一节 概述 第二节 基因工程药物的生产的过程第三节 目的基因的获得第四节 基因表达第五节 基因工程菌生物代谢的特点第六节 基因工程菌的不稳定性第七节 基因工程菌中试第八节 重组工程菌的培养第九节 高密度发酵第十节 基因工程药物的分离纯化第十一节 变性蛋白的复性第十二节 基因工程药物的质量控制第十三节 基因工程药物的制造实例2医学ppt第一节 概述 2医学ppt第一节 概述基因工程的概念 基因工程又称为重组DNA技术或基因克隆技术,在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，令其与载体构建成重组DNA，再转移到受体细胞

2、，目的基因在细胞中表达得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质,获得新的遗传性状 。3医学ppt第一节 概述基因工程的概念 基因工程又称为重组DNA技 基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因交流，在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟了新的领域、注入了新的方法，为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径，在农业、工业、医药等领域有巨大的应用前景。4医学ppt 基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因基因工程是生物技术的核心，基因工程技术的成就之一是用于生物治疗的新型药物的研制。世界上第一个基因工程产品人胰岛素（美国，1982年）中国第一个基因工程药物1b干扰素

3、（1997年）美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物药物研发榜首。5医学ppt基因工程是生物技术的核心，基因工程技术的成就之一是用于生物治为什么选择基因工程传统制药存在的问题： A.材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； B.内源生理活性物质，或造价太高，令人望而却步，或来源困难而供不应求； C.由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制； D.提取中难免感染，后果严重。 基因工程技术的特点：就是能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。6医学ppt为什么选择基因工程传统制药存在的问题：6医学ppt生化提取 基因工程表达人生长激素（

4、侏儒症）成本高产量低质量难以保证成本低产量高活性强性质优 50具新鲜尸体脑下垂体中提取 基因工程1-2升细菌培养液7医学ppt生化提取 基因工程表达人生长激素（基因工程药物在解决癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等方面取得明显的效果，为上述疾病的治疗、预防和诊断提供了新型药物、新型疫苗和新型诊断试剂。8医学ppt基因工程药物在解决癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等基因工程技术可生产的药物和制剂包括：免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；激素，如胰岛素、生长激素、心素纳；酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织

5、型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。9医学ppt基因工程技术可生产的药物和制剂包括：免疫性蛋白，如各种抗原和基因工程技术生产药品的优点： a. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质； b. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；d. 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；e. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选 源。 10医学ppt基因工程技术生产药品的优点：10医学ppt关于中国20世纪70主末，开

6、始应用DNA重组技术、淋巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开发新产品 改造传统制药工艺。“863”高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是：新型药物、疫苗和基因治疗，重点是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。我国基因工程药物主要集中在仿制上。下游技术落后于上游技术11医学ppt关于中国20世纪70主末，开始应用DNA重组技术、淋巴细胞杂第二节 基因工程药物生 产过程12医学ppt第二节 基因工程药物生 产过程12医学ppt基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制

7、和表达的技术13医学ppt基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿基因工程药物制造的主要步骤目的基因的克隆构建DNA重组体构建工程菌目的基因的表达外源基因表达产物的分离纯化产品的检验14医学ppt基因工程药物制造的主要步骤目的基因的克隆14医学ppt制备基因工程药物的基本过程获得目的基因组建重建质粒构建基因工程菌培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装15医学ppt制备基因工程药物的基本过程获得目的基因组建重建质粒构建基因工基因工程的上游和下游目的基因载体重组DNA分子重组DNA进入宿主细胞转化/转染工程菌大规模培养表达产物分离纯化诱导上游下游实验室工厂化、产业

8、化、商口化16医学ppt基因工程的上游和下游目的基因载体重组DNA分子重组DNA进入基因工程重组菌构建示意图17医学ppt基因工程重组菌构建示意图17医学ppt上游阶段： 主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。下游阶段： 从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，

9、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。基因工程药物生产的上游和下游18医学ppt上游阶段：基因工程药物生产的上游和下游18医学ppt第三节 目的基因的获得克隆基因的常用方法： 基因组文库法（原核）反转录法（真核）PCR法（原核+真核）反转录-聚合酶链反应法（真核）化学合成法（原核+真核）旧基因改造法（原核+真核）19医学ppt第三节 目的基因的获得克隆基因的常用方法： 19医学ppt一 构建基因组文库分离目的基因 基因组DNA（genomic DNA）：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有DNA序列。基因组文库：将某种细胞的基因组DNA切成一定大

10、小的片段，并与适当的载体重组后导入宿主细胞，这种含有整个基因组DNA信息的集合。20医学ppt一 构建基因组文库分离目的基因 基因组DNA（genomic基因组文库（DNA文库）构建流程 分离基因组DNA 限制酶 大小不同酶切片段 片段酶切、回收、纯化 分别与适当的载体连接 载体 DNA连接酶 导入细胞 转化或转染 克隆 繁殖成菌落或嗜菌斑 鉴定 分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定 筛选根据基因决定筛选策略21医学ppt基因组文库（DNA文库）构建流程 分离基因组DNA筛选根据基因组文库法只适合原核基因的获得，不适用于真核基因。Notice: Why ?22医学ppt基因组文库法只适合原核基因的获得

11、，不适用于真核基因。Noti原核基因与真核基因的区别真核基因有内含子真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中很小一部分，为其10-5-10-7，即使多拷贝基因也只有10-5，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极其困难真核基因的反转录克隆法23医学ppt原核基因与真核基因的区别真核基因有内含子真核基因的反转录克隆二 反转录法从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成与该mRNA互补的DNA（cDNA第一链），再以 cDNA第一链为模板，最终合成双链DNA序列。cDNA不含内含子。获得cDNA文库。24医学ppt二 反转录法从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶反

12、转录合成基因的步骤： mRNA的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA的克隆 将重组体导入宿主细胞 cDNA文库的鉴定 目的cDNA克隆的分离和鉴定25医学ppt反转录合成基因的步骤： mRNA的纯化 cDNA克隆示意图mRNA逆转录酶ss-DNA逆转录酶ds-cDNAds-cDNARNaseH酶解除去mRNADNA聚合酶I核酸酶S126医学pptcDNA克隆示意图mRNA逆转录酶ss-DNA逆转录酶ds-1. mRNA的纯化细胞内含有3种以上的RNA，mRNA占细胞内总RNA总量的2%5%，真核细胞中mRNA的3-末端含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，足以吸附于寡聚脱

13、氧胸苷酸Oligo(dt)-纤维柱上，可用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。27医学ppt1. mRNA的纯化细胞内含有3种以上的RNA，mRNA占细2. cDNA第一链的合成可用寡聚脱氧胸苷酸（dt）作为引物，在反转录酶作用下，开始cDNA链的合成。3. cDNA第二链的合成除去cDNA-mRNA杂合链中的mRNA链（碱解或RNaseH酶解）然后以cDNA第一链为模板开始合成cDNA第二链。由于第一链cDNA3-末端会形成发夹结构，所以可从这点开始合成第二链（Klenow酶或DNA聚合酶I）切除发夹结构（核酸酶S1，专一性切除单链DNA）28医学ppt2. cDNA第一链的合成可

14、用寡聚脱氧胸苷酸（dt）作为引物4. cDNA克隆用于cDNA克隆的载体有两类： 质粒DNA（如pUC、pBR322等） 10kb根据重组后插入的cDNA能否表达、转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为： 表达型载体（pUC、gt11）有启动子 非表达型载体（pBR322、gt10 ）29医学ppt4. cDNA克隆用于cDNA克隆的载体有两类：29医学pp5. 将重组体导入宿主细胞以转化或转染的方向使重组DNA进入宿主细胞。6. cDNA文库的鉴定目的：评价库的好坏表型改变 抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变结构特征 凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析30医学ppt5. 将重组体导入宿主细胞以转

15、化或转染的方向使重组DNA进入7. 目的cDNA克隆的分离和鉴定核酸探针杂交法 根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，众cDNA文库中分离特异的cDNA克隆。免疫反应鉴定法 用表达型载体构建的cDNA文库，可用免疫学方法逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的cDNA克隆。31医学ppt7. 目的cDNA克隆的分离和鉴定核酸探针杂交法31医学pp三 PCR法直接克隆基因PCR-多聚酶链式反应 (Polymerase chain reaction)PCR是一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶、引物和四种dNTP的情况下，通过高温变

16、性（90-95)退火，延伸这样反复循环的过程，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。可从基因组中、载体上扩增基因32医学ppt三 PCR法直接克隆基因PCR-多聚酶链式反应 (PolyPCR的条件模板 双链DNA引物 dNTP 原材料：A、T、G、CDNA聚合酶 链的延伸33医学pptPCR的条件模板 双链DNAPCR三步曲PCR 反应分三步完成：第一步 变性 -95高温下，双链DNA 变性成为单链。第二步 退火-适当温度下，引物 DNA结合在适于配对的DNA片断上。第三步 延伸-72，由DNA 聚合酶催化，从引物开始利用四种脱氧核糖核苷酸合成目的基因DNA。34医学pptPCR三步曲P

17、CR 反应分三步完成：第一步 变性 -95PCR原理示意图35医学pptPCR原理示意图35医学ppt36医学ppt36医学ppt四 反转录-聚合酶链反应法 反转录与聚合酶链反应（PCR）结合的方法：mRNA经反转录合成cDNA第一链后，不再合成cDNA第二链，而是在特异引物协助下，用PCR方法进行扩增，特异地合成目的cDNA链。37医学ppt四 反转录-聚合酶链反应法 反转录与聚合酶链反应（P五 化学合成法较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸序列或目的蛋白质的氨基酸序列，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。方法：合成目的

18、基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。设计合成纯化组装38医学ppt五 化学合成法较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成化学合成基因的限制：不能合成太长的基因。最长50-60 bp，只适用于克隆小分子肽的基因。人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。费用太高。39医学ppt化学合成基因的限制：不能合成太长的基因。最长50-60 bp六 对旧基因的改造 蛋白质工程： 通过对基因功能相关区域的研究，采用基因修饰技术和点突变技术进行基因新功能研究和再确认，从而改变基因表达产物的生物学功能。4