【实用文档】无菌取样技术

1、无菌取样技术本单元讲述了无菌取样操作， 在讨论无菌取样的原因和采集方法之前， 必须 要理解“无菌的”的这一术语，“无菌”一般用于取样中，意味着取样过程中， 避免操作引起污染。一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，即：在收集 过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中。无菌样品的采集基本是为了支持、针对工厂的卫生条件状况的检查结果。一、检验前的准备工作：1包装无菌取样的工具：拥有正确的采取产品或加工过程的无菌取样器械工具是至关重要的的。 除非 使用合适的采集工具， 否则样品的完整性会被怀疑， 甚至样品毫无意义。 为了避 免没有合适的取样工具，建议建立一个无菌取样的分析清单，来收集取样工具。

2、如果可能盛样品的容器在最初进入加工区之前应当被预先标识， 象样品号、取样 日期、取样人等。 这样可以使在不同的工厂条件下的样品取样更为方便一些。 附 加样品号码一般在样品采集中被正式确定下来，因此不用预先标明。人员的工具设施， 象工作服、发网或消毒处理过的清洁的鞋靴必须具备有助 于证明采集者没有污染到食物产品或样品。2生产线样品 In-Line Samples ：生产线样品一般是指原材料， 原料生产用水、 包装材料或其他任何使用在生 产线的材料。生产线样品的采集一般用来确定细菌污染源是否来自于原材料或加工序中 的某些地方。3环境样品：环境样品用细菌拭子， （注：细菌拭子样品不能给出测出微生物的

3、定时结 果，因为样品非常小，显著微生物会经常丢失），棉拭子的取样部位一般来自于 食品接触面，地板喷溅物。墙壁、顶部管道和检验中考察的其他潜在污染源程序， 并且记录可能的联系， 在环境样品来源和食物产品的污染方面， 可以使样品具有 意义，并且是提倡这样做的，例如：地面喷溅水：工人从有地面污水的地方走过后又回到加工区域吗？墙壁：墙壁上面和在制品上面有昆害虫吗？天花板：冷凝物或喷漆有无掉落到产品上或被发现与产品相接触？4某些准备干冰：（有的称为 gel backs ）如果使样品在贮运过程中保持冷却， 一些种类的制冷剂是必需的。 检查观看 干冰袋子是否有接触， 如果泄漏可能污染样品， 你也可以用湿冰，

4、 湿冰可以由工 厂提供，然而取样前必须清楚这一点， 如果想保持样品冷冻， 干冰应在检验前获 得。盒子或制冷皿：检验员需要贮藏、 运输他们的样品， 如果样品不需冷冻， 那么用一个盒子即 可，但如果样品需要冷却， 一个标准的制冷皿或保温箱是必须使用的， 一般来讲 制冷皿随带着一个塑料袋， 样品可以放还袋子里， 制冷剂象干冰， 等可以放置在 袋外，这样样品被冰污染的可能性就被避免了。灭菌容器：从塑料袋到灭菌的加仑漆桶，可以用于有锐利边面的产品如蟹、虾等。取样工具：取样工具包括：茶匙、角匙、尖嘴钳、 fovceps tongs 量筒和烧杯，工具的 类型一般由取样产品来决定。所有取样设施和容器的灭菌日期

5、应当被检查、 灭菌时间应当在仪器设施的标 签和包装上标明， 一些仪器设施可以在当地实验室灭菌处理或购买灭菌仪器， 在 当地实验室灭菌的仪器设施一般可以保持至少两个月，过期后设施必须重新灭 菌。灭菌手套：灭菌手套在采样中并非必须启用， 如果一个产品在样品收集过程中必须被接 触，那么最好让工厂生产线的工人来做（加工处理产品的工人），将样品放入收 集容器中， 既然工人在生产过程中处理接触产品， 那么我们就不能认为他们对产 品又有附加的污染。当用手套时必须用一种避免污染的方式戴上， 手套的大小必须适合工作的需 要。无菌棉拭子：一般用于拭取仪器设施和工厂环境区域，使用棉拭子一般有一个正确的程 序，打开棉

6、拭子剥掉表皮， 然后必须小心的放在试管头上， 注意不要沾染棉拭子 的外端； 下一步擦拭要取样的部位， 象案板头或顶部管道， 然后从试管头上小心 翼翼地将拭子放入将其全部堆入直到试管中部。灭菌全包装袋：袋子必须购买灭菌的， 使用时只需撕掉封头， 用提供的地方张开袋子， 将样 品放入，然后将袋子顶端卷起，用线绳扎实牢；底部应当折叠两次，以便线绳不 会穿透塑料袋，导致样品泄露。当样品收集时， 样品采集时的条件例如产品的温度、 地点等， 连同扦样样品 号唛头，一并记录入检验员的注释说明中， 取样的样品可以从样品号、 采集日期、 附加样品号，最初调查人和其他鉴别信息事区分。当采集无菌样品时，一条最重要的

7、规则是：千万别污染样品。这需要样品采集人非常小心地采集所有附加样品，确保不违反这条规则。二、取样方案微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质 量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对 结果判定产生重大影响。 要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案， 其 次使用正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。一般说来，进出口贸易合同对食品抽样量有明确规定的，按合同规定抽样； 进出口贸易合同没有具体抽样规定的， 可根据检验的目的， 产品及被抽样品批的 性质和分析方法的性质确定抽样方案。 目前最为流行的抽样方案为 ICMSF推

8、荐的 抽样方案和随机抽样方案， 有时也可参照同一产品的品质检验抽样数量抽样， 或 按单位包装件数 N 的开平方值抽样。 无论采取何种方法抽样， 每批货物的抽样数 量不得少于 5 件。对于需要检验沙门氏菌的食品， 抽样数量应适当增加， 最低不 少于 8 件。ICMSF推荐的抽样方案ICMSF的采样设想及其基本方法用于分析所抽样品的数量、 大小和性质对结果会产生很大影响。 在某些情况 下用于分析的样品可能代表所抽“一批”（ lot ）样品的真实情况，这适合于可 充分混合的液体，如牛奶和水。在“多批”（ Lots 或“ batchers ”）食品的情况下就不能如此抽样，因为 “一批”容易包含在微生物

9、的质量上差异很大的多个单元。 因此在选择抽样方案 之前，必须考虑诸多因素（ ICMSF， 1986），包括：检验目的产品及被抽样品的性质分析方法ICMSF提出的采样基本原则，是根据（ 1）各种微生物本身对人的危害程度 各有不同。（ 2）食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：降低危害度； 危害度未变；增加危害度，来设定抽样方案并规定其不同采样数。目前，加 拿大、以色列等很多国家已采用此法作为国家标准。 在进行详细叙述之前， 先解 释四个代号：n：系指一批产品采样个数c：系指该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数 限量的最大允许数。m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接受的数

10、量区别开。M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的 不可接受数之间的界限。1ICMSF的采样方法有些实验室在每批产品中， 仅采一个检样进行检验， 该批产品是否合格， 全 凭这个检样来决定。 ICMSF方法与此不同，它是从统计学原理来考虑，对一批产 品，检查多少检样，才能够有代表性， 才能客观地反映出该产品的质量而设定的。 ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有 n、及 m值，三级法则 有 n、c、m及 M值。 M即附加条件后判定合格的菌数限量。（1）二级抽样方案。自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点 作为食品微生物的限量值， 只设合格判定标准

11、m值，超过 m值的，则为不合格品。 检查在检样是否有超过 m值的，来判定该批是否合格。 以生食海产品鱼为例 n=5， c=0， m=102，n=5即抽样 5 个， c=0即意味着在该批检样中，未见到有超过 m值 的检样，此批货物为合格品。（2）三级抽样方案。设有微生物标准 m及 M值两个限量如同二级法，超过 m值的检样，即算为不合格品。其中以 m值到 M值的范围内的检样数， 作为 c值， 如果在此范围内，即为附加条件合格，超过 M值者，则为不合格。例如：冷冻生 虾的细菌数标准 n=5，c=3，m=101，M=102，其意义是从一批产品中， 取 5 个检样， 经检样结果，允许 3 个检样的菌数是

12、在 mM值之间，如果有 3 个以上检样 的菌数是在 mM值之间或一个检样菌数超过 M值者，则判定该批产品为不合 格品。（3） ICMSF对食品中微生物的危害度分类与抽样方案说明为了强调抽样与检样之间的关系， ICMSF已经阐述了把严格的抽样计划与食 品危害程度相联系的概念（ ICMSF， 1986）。在中等或严重危害的情况下使用二 级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。ICMSF是将微生物的危害度、 食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食 品中微生物危害度分类的。 这个设想是很科学的， 符合实际情况的， 对生产厂及 消费者来说都是比较合理的。下面结合表 1 加以说明。表 1、 I

13、CMSF按微生物的危害度及食品处理进行情况分类级 别危害程度对象微生物食品经不同处理后的危害度减少（加热）无变化（冷 冻品立刻进 食）增加危害度（未 加热吃到吃前还 有一段时间）1. 食品的保藏细菌数例1例2例32. 轻度间接指大肠菌群n=5 c=3n=5 c=2n=5 c=1级标菌方大肠杆菌例4例5例6案金黄色葡萄球菌n=5 c=3n=5 c=2n=5 c=1（指标菌）3. 中度程度局 部传播金黄色葡萄球菌蜡样芽孢杆菌例7例8例9产气荚膜梭菌n=7 c=2n=5 c=1n=10 c=11. 中度程度广沙门氏菌副溶血例 10例 11例 12级泛传播性弧菌致病性大方肠杆菌n=5 c=0n=10

14、c=0n=20 c=3案2. 严重程度肉毒梭菌例 13例 14例 15霍乱弧菌n=15 c=0n=30 c=10n=60 c=0伤寒沙门氏菌副伤寒沙门氏菌注：表中“减少”系指食品经加热杀死污染的细菌无变化”系指微生物数不增减例如冷冻食品或干燥食品。增加”系指将食品保存在不良环境中使微生物易于繁殖和产毒。根据上表 15种情况的举例， 1-3 可用三级法， 4-5 可用二级法来判定是否合考虑到以上 15 种情况，分别设定不同的取检样数及检样污染数，在 1-9 例 种检样需采 5个（ n=5），而污染检样数设定为 c=3，2，1。在 10-15 例用二级 法则不得检出该致病菌 c=0。例如冷冻食品，

15、细菌数按例 2，大肠菌按例 5，金 黄色葡萄球菌按例 8，沙门氏菌按例 11 的二级法判定。对食品处理应酌情考虑， 例如生肉火腿中的金黄色葡萄球菌， 被腐败菌所抑 制，不易发生食物中毒，适用例 7 和例 8。烹调加工后的熟肉，对腐败菌没有抵 抗力，则易发生食物中毒，适用例 9。加热盐腌的火腿，水分活性为 0.86 以下， 金黄色葡萄球菌有增殖的可能性，因此适用例 9。沙门氏菌水活性在 0、94 以下 不能繁殖，适用例 11，如上所述，应根据各种食品的危害度进行设定。ICMSF方法是以二级法、三级法和抽样的概念为基础，再将微生物的知识加进来，则可以提出各种食品的微生物标准。如表 2。为了安全，冷

16、冻生虾加热吃，减少危害度适用例 1、 4、 10。冷冻加工虾， 为了不加热就食，在解冻中有增强危害度的可能性，适用例 3、 6、 9、12，对象 微生物特别指定金黄色葡萄球菌肠毒素， 两者虽菌数限量是相同的， 但情况有所 不同，分别适用 c=3，c=1，因此不依靠菌数限量，而用合格率来控制。表 2、 ICMSF虾的微生物标准食品名称检查项目例级别nc菌数限量 /gmM冷冻生虾细菌数1353106107大肠菌群43534400金黄色葡萄球菌435310332103冷冻烹调副溶血性弧菌10250102虾细菌数3351106107大肠菌群63514400金黄色葡萄球菌93511032103副溶血性弧

17、菌122501024）. 随机 抽样方案在现场抽样时， 可利用随机抽样表进行随机抽样。 随机抽样表系用计算机随 机编制而成，包括一万个数字。其使用方法如下：先将一批产品的各单位产品（如箱、包、盒等）按顺序编号。如将一批600 包的产品编为 1、2600。随意在表上点出一个数。查看该数字所在的行和列。如点在第 48 行、第 10 列的数字上。根据单位产品编号的最大位数（如 A1，最大为三位数），查出所在行的 连续列数字（如 A2所点数为第 48行、第 10、11和 12列，其数字为 245），则 编号与该数相同的那一份单位产品，即为一件应抽取的样品。继续查下一行的相同连续列数字（如按 A3、即第

18、 49行的第 10、11和 12 列的数字，为 608）。该数字所代表的单位产品为另一件应抽取的样品。依次按 A4所述方法查下去。当遇到所查数超过最大编号数量（如第50行的第 10、11 和 12 列的数字为 931、大于 600）则舍去此数，继续查下一行相 同列数，直到完成应抽样品件数为止。三、抽样方法确定了抽样方案以后， 抽样方法对抽样方案的有效执行和保证样品的有效性 代表性至关重要。 抽样必须遵循无菌操作程序， 抽样工具如整套不锈钢勺子、 镊 子、剪刀等应当高压灭菌，防止一切可能的外来污染。容器必需清洁、干燥、防 漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。抽样全过程中，应采取必要的措施防止食 品

19、中固有微生物的数量和生长能力发生变化。 确定检验批， 应注意产品的均质性 和来源，确保检样的代表性。常见的抽样方法有：1直接食用的小包装食品：尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。2统装或大容器包装的液体食品：（1）抽样前摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质；（2）抽样时应先将抽样用具浸入液体内略加漂洗，然后再取所需量的样 品，装人灭菌盛样容器的量， 不应超过其容量的四分之三， 以便于检验前将样品 摇匀；（3）取完样品后，应用消毒的温度计插入液体内测量食品的温度，并作 记录。尽可能不用水银温度计测量，以防温度计破碎后水银污染食品；4）如为非冷藏易腐食品，应迅速将所抽样品冷却至0- 43统装或大容器包装的固体和固体食品：（1）每份样品应用灭菌抽样器由几个不同部位采取，一起放入一个灭菌 容器内；（2）注意不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。4统装或大容器包装的冷冻食品（1）对大块冷冻食品，应从几个不同部位用灭菌工具抽样，使之有充分 的代表性。（2）在将样品送达实验室前，要始终保持样品处于