酒精发酵实验方案

1、酒精发酵试验酒精发酵试验一、试验目的把握酵母菌的筛选方法复习用显微镜观看菌形态的操作步骤产酒精力量的测定、及其乃酒精的力量、把握用 DNS 法测定复原糖及其酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力二、试验器材学习酒精出酒率的计算二、试验器材试验器材棒，离心管，离心机，漏斗，滤纸，玻璃珠， pH 试纸试剂及药品2020500/ml DNS试剂，可溶性淀粉，葡萄糖番茄PDA马铃薯200g蔗糖或葡糖糖20g琼脂15-20g水1000mlPH自然1000ml。12130min。DNS试剂技术路线一优良酵母获得。四、试验步骤一酵母菌种的驯化筛选1. 酵母菌种的筛选分别10-3、10-4、10-5后在技术路线一优良

2、酵母获得。四、试验步骤一酵母菌种的驯化筛选1. 酵母菌种的筛选分别10-3、10-4、10-5后在PDA培育基平板上涂布，后置于 28隔水式恒温培育箱中静止培育 3 d；从分别得到的酵母菌落中挑取一环酵母菌在 PDA 平板上划线，后置于 28隔水式恒温培育2 d。2.酒精发酵液的微生物检查1酵母形态的观看10 40 倍的显微镜下：0.1%美蓝染色液，液滴不行过多或过少，以免盖上48 小时的啤酒酵母少许，放在美蓝染色液中，是菌体与染色液均匀混合。片的一边与液滴接触，然后将盖玻片渐渐放下，这样可以避开产生气泡。地进展着，所以细胞内氧化复原值(rH)颇小，而复原力强，假设有无毒的染料进入酵母菌是单细

3、胞的真核生物，细胞核和细胞质有明显分化，个体比细菌大得酵母菌是单细胞的真核生物，细胞核和细胞质有明显分化，个体比细菌大得母菌是通过芽殖进展生殖，因此有时可以观看到带有芽的菌株。二测定指标及其方法1. 酵母生产性能鉴定酵母菌产酒精力量发酵力的测定本试验主要实行称重法与测放出的 CO2 量等测定酵母的发酵力。称重法:我们将不同酵母菌产酒精力量的测定和酒精发酵合在一起。:玉米粉 1000ml250ml24h的酵母1ml 移液枪和枪头 玻璃操作：625mL 1：5 125g，在电糖化：待醪液冷却到60，调整pH 值至 4.04.5按 0.60.8%/g 淀粉量取糖化酶参加糖化锅中，搅拌均匀，放入水浴锅

4、中，保持温度为60，10h，用碘液测定糖化液是否含还有淀粉，假设未完全则连续糖化直至完全为止。留意开头时液面位置并随时补足由于水的蒸发造成的液面降低。pH 5.0 左右。取一些糖化好的糖化液，测定其复原糖的含量用 DNS 法测定。5 250 150 毫升10%15 毫升。28-30的培育箱中发酵，并于以后每天称量一次，直至重量减至恒重为止。酵母菌耐酒精力量的测定：230和不同的酒精浓度0%、3%、6%、9%、12%、15%、18%条件下进展试验 ，定期取样检测活细胞目：菌体的耐酒精力量以酵母细胞增长数表示，酵母细胞增长数本试验承受本斯值法。将酵母茵在 30度摇床中摇瓶培育 36 h，离心弃上清

5、3 1 g15 mL的离心管中，注入10 mL pH4.52020 min本试验承受本斯值法。将酵母茵在 30度摇床中摇瓶培育 36 h，离心弃上清3 1 g15 mL的离心管中，注入10 mL pH4.52020 min5 i0 min 斯值。依据本斯值推断酵母菌株的分散性强弱。三发酵前后发酵液中复原糖含量的测定DNS法 540 nm 波长下进展比色测定，测定酒样的光密度值，确定番茄酒中总糖含量，操作简捷，杂质干扰少。酶活的定义：1 mL酶液于上述条件下，1min 1mol 葡萄糖量的酶量 “IU”。标准曲线的绘制本试验承受35二硝基水杨酸比色定糖法(DNS)按表1进展葡萄糖标准曲线溶液配置

6、，用分光光度计540 nm下进展比色测定，用坐标，绘制标准曲线，用回归方程计算出相应的葡萄糖含量。表1 葡萄糖标准曲线溶液配置表Table1 Preparation of solution for glucose standard curve项目空白12345678含糖总量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖液(mL)00.20.40.60.81.01.21.41 .6蒸馏水(mL)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS 试剂(mL)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5蒸馏水定容沸水浴加热10 min马上用流水冷却定容至25

7、mL发酵前后发酵液中复原糖含量的测定5ml pH4.6 的醋酸盐缓冲液进展稀释，大约稀10 1ml 1mlpH4.6 2mlDNS 试剂。混匀后沸水浴5min5ml540nm 处比色，用乙管调零，测3 次，记录光密度值。然后在标准曲线上查得相应的复原糖含量 G mg。再由下式计算样品中复原糖的含量：复原糖含量(mgmL)=Ga式中：a一稀释倍数G一复原糖量(mg)四酒精生产中糖化型淀粉酶的酶活力测定原理：糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖，包括淀粉-1，4-麦芽糖苷酶-淀粉酶、淀粉-1，4-葡萄糖糖苷酶4-葡萄糖苷酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非复原性

8、末端开头，分解-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反响生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。碘量法原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖具有复原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。I2+2NaOHNaIO+NaI+H2O NaI体系中参加过量的碘，氧化反响完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。I2+2Na2S2O3Na2S4O6+2NaI仪器：吸管25ml、10ml、5ml、2ml定碘瓶；碱式滴定管；恒温水浴锅；分析天平。试剂：12%可溶性淀粉2g1002h 至恒重，用少量蒸馏水调匀， 20.2mol/LpH4.6 醋酸钠缓冲液称取醋酸钠(CH3COONa3H

9、2O)2.722，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1 100ml49ml 51ml 混匀。缓pH。320%氢氧化钠溶液40.1mol/L碘液100m1 1000ml 贮存于棕色瓶中。50.1mo1/L氢氧化钠溶液4g1000ml。61mol/L硫酸溶液5.6ml80 m1 蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。70.1mol/L硫代硫酸钠溶液配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O35H2O)24.82g 0.2g硫代硫酸钠溶液在 pH9-10 时最稳定溶于煮沸后冷却的蒸馏水中无CO2，定容 硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。试

10、验步骤：待测酶液的制备取发酵液的滤液用 pH4.6 醋酸钠缓冲液适当稀释，供测定用。酶活力的测定2%25m1 0.2mol/L pH4.6405-10min，在甲管中参加待2ml(100-170单位)2ml 蒸馏水作比照，摇匀，马上1h 20%NaOH0.2m1 终止酶反响，冷却至室温。5m1 0.1mol/L10ml，再参加15ml15min1mol/L2m1，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至无色为终点。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差46 之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。计算：pH4.6的条件下，1 小时水解可溶性淀粉1 毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。酶活力单位=A-B

11、)N 90.05 1/2 32.2/5 n式中 ：A空白所消耗硫代硫酸钠体积ml； B样品所消耗硫代硫酸钠体积ml；N硫代硫酸钠浓度0.1mol/L；90.051mllmol/L硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质mg；1/2 1m1 酶液的量32.2反响液总体积ml5吸取反响液样品的体积ml；n 酶液稀释倍数。留意事项：的差数为 36ml 左右(以每毫升约 5090 单位为宜)。2配制碘液时碘先和碘化钾溶解，溶解完全后再稀释。五酒精蒸馏与含量的测定:比重计测定法：材料：酒精比重计。100ml 量筒。温度计。100ml 500ml 100ml，停顿蒸馏，摇匀备用。与弯月面下缘相平。校正：依据所量的酒精度和温度、查表校正为 20时酒精度。实际发酵产无水酒精发酵率%理论发酵产无水酒精 100成熟发酵醪中含酒精发酵液中糖份0.6479 100六计算酒精出酒率0.6479发酵糖转化为酒精的转化系数葡萄糖发酵生成乙醇的反响式为：C6H12O62C2H5OH+2CO2由于淀粉糖化液中几乎都是可发酵性糖，可依据上式算出糖醇转化的理论值。=实际所得酒精量/理论上所得酒精量100%酒精对糖或对淀粉的转化率是衡量酒精生产水平的一项重要指标，直接影响生产本钱。它与酵母的活性及用量、发酵时间、温度、pH 值及是否污染上杂CO2 的