光镜与电镜技术3、绪论

1、上海水产大学生命学院周平凡光镜与电镜技术第二部分:电子显微镜技术（电子显微镜和电子显微术的总称） 一、概 述：第一章:电子显微镜的原理和结构第一节:几个常用的基本概念第二节:透射电子显微镜第三节:扫描电子显微镜第四节:其他类型的电子显微镜第二部分:电镜技术第二章:超薄切片技术第一节:取材第二节:固定和固定剂第三节:脱水第四节:浸透和包埋第五节:超薄切片第二部分:电镜技术第三章:电子染色技术第一节:电子显微镜标本的正染色第二节:电子显微镜标本的负染色第三节:半薄切片染色第二部分:电镜技术第四章:扫描电镜生物样品制备技术第一节:取材和标本的预处理第二节:生物样品的干燥第三节:生物样品的导电法第二部

2、分:电镜技术电镜有很高的分辨率-能看到生物样品的表面和内部超微结构。 通过多种电子显微术的配合-能了解生物样品的化学组成、形态结构和生理功能的关系。 电镜技术-无论在生物技术的基础研究中、还是在临床医学, 都有着广阔的发展前景。一、概 述一、概 述一、电子显微镜的概况 透射电镜的点分辨率达到了2-3A,晶格分辩率已达到1A左右,已使人们能用电镜直接观察原子象； 除透射电镜外,发展了多种电镜,如扫描电镜、扫描透射电镜、分析电镜等,使我们能对样品进行综合研究。一、概 述一、概 述（一）透射电镜 透射电镜-是利用电子射线穿透样品后放大而成像的一种电镜。 主要优点-分辨率高,可用来观察组织和细胞内部的

3、超微结构以及微生物和生物大分子的全貌,在生物医学上的应用最为广泛。 加速电压-一般透射电镜（加速电压小于120KV）,高压透射电镜（加速电压在120KV与500KV之间）,超高压透射电镜（加速电压大于500KV）。一、概 述1、一般透射电镜：就是最常用的100KV电镜。 这种电镜的分辨率高(点3A,晶格1.4A),但穿透本领小,观察样品必须很薄,如小于0.1微米的超薄切片、负染样品和复型膜等。 这种电镜在生物医学上的应用已相当普及。一、概 述一、概 述一、概 述3、超高压透射电镜：已有500KV、1000KV和3000KV的超高压电镜。 这种电镜具有穿透能力强、辐射损伤小、可以配备环境样品室及

4、进行各种动态观察等优点,分辨率也已达到或超过100KV电镜的水平。 在超高压电镜上附加充气样品室,使人们有可能观察活细胞内超微结构的动态变化,对生物医学工作者很有吸引力。这种电镜庞大而且昂贵,远非一般实验室所能装备。一、概 述 东京大学工学院125万伏超高压电镜（JEOLARM1250），该电镜价值1000万美元，有三层楼那么高，是世界上精确度最高的电镜之一，主要用于原子结构和物质的特性研究。 一、概 述 该电镜的开放管理每天24小时向“全世界”开放。 尽管是高精度特大型电镜，他们仍然实行用户经培训合格后自行上机的开放模式。 原则上，电镜实行测试收费管理，但他们电镜开放的重点是从事高水平的测试

5、服务与科学研究。 一、概 述 如果用户的样品不需要在这样高水平的电镜上测试，即便是付费，他们也不予测试，因为这等于是浪费了高水平的资源。相反，如果用户提出的样品或课题有很高的学术、科学技术价值，即便资费不够，他们也会主动接受。一、概 述（二）扫描电镜 扫描电镜是利用电子射线轰击样品表面,引起二次电子等信号的发射,经检测装置接收后成像的一种电镜。特点是景深长,所获得的图象立体感强,可用来观察生物样品的各种形貌特征。 在生物医学中,采用不同的样品制备技术可观察不同的结构,如用临界点干燥方法可观察样品的表面形貌； 用冷冻割裂方法可观察样品割裂面的结构,用铸型方法可观察管腔内表面的结构等。一、概 述一

6、、概 述1、一般扫描电镜 目前一般商品扫描电镜采用热发射电子枪,分辩率为60A左右,若采用六棚化镧电子枪,分辨率可提高到40-50A。 这种电镜在生物医学中的应用也已相当普及。一、概 述一、概 述一、概 述（四）扫描透射电镜 扫描电镜中电子射线作用于样品后,其中一部分电子可透过样品成为透射电子,将透过样品的透射电子和散射电子用检测器接收成像,即成为扫描透射电镜。 这种电镜一般用场发射电子枪,兼有透射电镜、扫描电镜和分析电镜的特点,能观察较厚的样品,分辨本领和成象质量都很好,是近年来电镜技术的最大改进之一。一、概 述二、电子显微术的概况 电镜具有很高的分辨本领,能观察极微小的结构。但是电镜不能直

7、接观察天然状态下的生物标本,必须通过各种技术将生物标本制成特殊的电镜生物样品,才能放入电镜进行观察,这些电镜样品制备技术称为电子显微术。 电镜能在生物医学领域中广泛使用,在很大程度上是由于电子显微术的改进和发展。电子显微术种类很多,这里仅介绍几种常用的技术。一、概 述1、超薄切片技术 由于电子射线穿透本领很差,对厚于0.1微米的切片就很难透过。因此,必须把生物标本切得很薄才能在透射电镜下观察。 超薄切片技术就是通过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤,将生物标本切成薄于0.1微米超薄切片的样品制备技术,用于生物组织的内部超微结构研究。 超薄切片技术是所有电镜生物样品制备技术中最常用、最基本的一种

8、技术。（一）与透射电镜有关的电子显微术2、负染色技术 利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷鸽酸纳、醋酸铀等）将生物标本包围起来,增强背景散射电子的能力以提高反差,在黑暗的背景下显示标本的形态结构,称负染色技术。 这一技术操作简便,主要用于颗粒状标本（如细菌、病毒、分离细胞器等）的研究。（一）与透射电镜有关的电子显微术4、电镜细胞化学技术 利用各种细胞化学反应,在超微结构水平上研究细胞成分的分布和变化的方法称电镜细胞化学技术。 这一技术把细胞超微结构与其化学组成有机地联系起来,目前主要用于研究细胞内各种大分子物质和酶的定位等。（一）与透射电镜有关的电子显微术5、免疫电镜技术 这是一种使抗原在超微

9、结构水平上定位的技术,应用与抗原相应的标记抗体,在电镜下观察标记物的位置,从而定位相应抗原。 这一技术有灵敏度高、特异性强的特点。（一）与透射电镜有关的电子显微术1、表面观察样品制备技术 扫描电镜适合于研究生物样品的表面特征,样品制备包括观察面暴露、固定、干燥和导电等步骤,使表面特征充分暴露而不变形。 这一技术是扫描电镜样品制备的常规技术,主要用于组织、细胞、寄生虫等表面形貌的研究。（二）与扫描电镜有关的电子显微术2、生物标本割裂技术 将生物标本放在特殊包埋剂中经冷冻或其他方法国化,然后把固化的标本割裂,暴露组织和细胞的内部结构,再经干燥和导电后在扫描电镜下观察。 这一技术使扫描电镜能观察生物

10、标本的内部结构,目前最常用的是冷冻割裂技术。（二）与扫描电镜有关的电子显微术（一）在细胞和分子生物学方面的应用 电镜技术有力地推动了细胞生物学的发展,使许多在光学显微镜下长期不能解决的问题找到了答案。 由于电镜具有很高的分辩率,使人们对细胞结构的认识不断深入,从光学显微镜的显微结构水平提高到超微结构水平。三、电镜技术在生物医学上的应用 对光镜下已经发现的细胞器如线粒体、中心体等的结构和功能,在电镜下有了新的和更深入的了解； 对光镜下争论不休的细胞器如高尔基体,在电镜下得到了证实并作了深入的研究； 在电镜下发现了很多新的细胞器和结构,如内质网、微体、微管、微丝等；电镜技术还对细胞的膜系统、细胞骨

11、架和细胞联结的研究起着重要作用。 采用多种电子显微术相结合,使人们能够对细胞各部分的结构、代谢和功能联系起来进行动态的研究,从而极大地丰富了细胞生物学的内容。三、电镜技术在生物医学上的应用（二）在解剖学中的应用 对人体结构的认识是医学的重要基础,而这一种认识是随着技术的发展而不断深入的。 光学显微镜的出现使解剖学在大体解剖的基础上发展了显微解剖学（组织学）, 电子显微镜的出现则进一步发展了超微解剖学, 使人们对人体的认识达到了超微结构水平。三、电镜技术在生物医学上的应用（三）在微生物学中的应用 电镜技术在微生物学中的应用主要包括两个方面： 对光学显微镜下看得见的原虫、真菌、细菌等作进一步的超微结构研究； 对病毒的研究。现以病毒研究为