《分子实验》10 感受态细胞制备及转化实验（全）

1、目录来源螺旋网大肠杆菌感受态细胞的制备2一、CaCl 感受态细胞的制备32二、电转感受态细胞的制备4枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化14农杆菌感受态细胞的制备及转化17酵母感受态细胞的制备及转化 18关于载体连接的讨论23-1-大肠杆菌感受态细胞的制备体外连接的DNA 重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。为了提高受体菌摄取外源 DNA效率的方法，那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对 过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为

2、基因工程的常规技术，它对于我们利用体外 重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。细菌的转化有两种类型：一种是自然转化（naturaltransformation另一种是工程转化（engineered transformation得它们能摄入并转化外源。枯草杆菌中的转化属于自然转化，E.coli 转化就属于工程转化。对于E.coli，目前主要采用电转化法和CaCl 法将外源 导入受体细胞中，2并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl 2瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细91010 10 转化子/g DNA。而对于热激法，是利用冰冷的CaCl 267其

3、产生短暂的“感受态”，易于摄取外源 DNA。转化效率为 10 转化子/g。-2-一、CaCl 感受态细胞的制备2CaCl 感受态细胞的制备实验步骤2DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜（约16小时）；2取1ml 过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5-3 小时（250-300rpm3将0.1M CaCl 溶液置于冰上预冷；2以下步骤需在超净工作台和冰上操作4吸取1.5ml 培养好的菌液至1.5ml 离心管中，在冰上冷却10 分钟；54下3000 g 冷冻离心5分钟；6弃去上清，加入100l 预冷0.1M CaCl 溶液，用移液枪轻

4、轻上下吸动打匀，2使细胞重新悬浮，在冰放置20 分钟；74下3000 g 冷冻离心5 分钟；8弃去上清，加入100l 预冷0.1M CaCl 2细胞重新悬浮；9细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70胞的量）由个人根据实际情况掌握，不一定要死守以上的体积，但要保持试剂、菌体等量的平衡。提高感受态效率的关键如下述-3-注意事项：1.克隆的新鲜程度，一定要选新鲜平板的单克隆，即刚涂布生长过夜的平板；2.菌体的 值JM109 或BL21OD值为0.35DH5为0.4OD600值不要过高，更不能超过0.6；3.低温处理的时间，做完后冰上保存12

5、到24h后分装，并保存于80；4.试剂和用品，非如果有可能，所有的用品（离心管、摇瓶等等）用新的，如果使用旧的，要确保干净，CaCl 溶液要过滤除菌，不要高压灭菌。2二、电转感受态细胞的制备1、 -80冰箱保存的菌种在SOB固体平板上划单菌落；21ml SOB 37300rpm6 hr；3400ml SOB液体培养基的2L1:500300rpm，4hr，然后每隔2 测一次 ，至 =0.76；6006004、立刻置冰水浴中骤冷，可以选择在一个大的装有冰水混合物的容器里快速旋转摇动内有培养物的三角瓶，尽快使培养物温度降下来；5、随后在250ml 预冷的离心杯中离心，4，2000 g，10 min；

6、6后再把水加满，2200 g，10 min，弃上清；7、再用10%的甘油同样方法洗两次，2400 g，10 min；8 120l 分装到1.5 Ep 管（EP 管要-70 -70的乙醇迅速冰冻；-4-9、保存在-80冰箱中备用。以 DH10B 为例说明：步骤 1：每次做感受态都要新鲜划菌，不要使用保存于 4或室温的平板；尽量使用原代菌，最好不要用多次传代的菌；LB 平板也可以，但效率可能会降低；SOB 使用 GIBCO 体，使用普通的试剂配制培养基即可；步骤 2 3 不允许的话则按照实验室实际情况稍做修改，确保菌体生长良好；步骤 3 0.5 后过 2-3 就测一次 值；步骤 4温度降下来，不要

7、静置于冰水混合物中，摇动大约 10 min；步骤 5：建议使用离心杯，因为其底是平的，并且灭菌时里面要装上双蒸水,利于步骤 6，7 与 8 中的悬浮操作；步骤 6重悬起来以后再加满。用手摇动时保证培养基液面低于冰面，重悬过程中注意悬浮的菌团出现，需将其全部分散开；步骤 7：同上步骤 8 400ml 培养物制备 1-1.5mL 感受态为益；关于 EP 管预冷与-70的乙醇迅速冰冻的具体办法：在菌种保藏盒内加入适 EP -70 -80冰 1ml - 80冰箱；步骤 9- 70- 80的冰箱；以上方法适用于很多 E.coli XL1-BlueDH10BDH5，-5-JM109，BL21 等做电转感受

8、态，可能不同的菌株生长速度有差异，方案中的培养时间与最佳 值可能有变化，不妨用此方案尝试一下，如果效率不够高的话可以对所用的菌株进一步进行优化。注意：1. NaOH 溶液洗数次；2.重悬菌体用手振荡，不用振荡器；3.用枪吸打要轻，枪头需要剪去尖头；104.如果做的效果好，效率可以达到 10 以上。对于 E.coli 要用新的，不用洗涤剂，用手洗且保证彻底干净；相应的器材要作为制备感受态细胞专用，不做其他用途；试剂要选用最好的，尽量过滤除菌，不用高压灭菌等等。因为电转化效率更高，对要求转化率的实验，建议采用电转化的方法。附件 1. 晶美公司高效感受态细胞制作方法：版权归晶美公司所有，仅供大家参考

9、！方法一A液：1M，MnCl ：2B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液 称取 CaCl 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入 46ml三蒸2水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅 121高压灭菌备用。取 1管 B0.6ml C液(46ml) 1ml移液器加入 3.3mlA液，混匀冰浴即可使用。划线得到单菌落,37培养箱培养约 17小时， 挑取 2-4个形态饱满的单菌落接种于装有 100ml SOB 培养基的三角瓶,37剧烈振荡（300 rpms）培养 3-4小-6-时, 将培养温度调至 18

10、3280rpms每管加入 4mlTB 280ml（可用 1.5mlEP 15感受态的 EP 12小时以上。取出感受态放入-70超低温冰箱备用。 10*8 10*9贵材料的连接转化。洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过 2500g,建议 1500-2000g 5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴 220-30落出现。预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置 1min我经常加至 20ml，效果不错。关于大肠杆菌的感受态制备及转化的

11、方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将 LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的 EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到 1010，但是操作起来比较麻烦。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于 1990 年gene上刊登的由 Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。 GLP许多可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。1必讲的，毋庸置疑。-7-2谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角

12、瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。3 pH pH值并非单指配置或灭菌后的 pH整个摇瓶结束后的 pH pH值在 6.8-7.2以测一下 pH 6.0 6.5生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。4 OD OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调 OD 不得大于 0.60.8OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在 OD值的两方面影响中找一个平衡点。5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的 Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用 20mMMgCl2做为培养基的添加物，在感受

13、态收获之前 20-30分钟加入，会收到很好的效果。6可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 Inoue 的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。7DMSO的效率增加。8 12只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。方法二1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在 LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.2.挑直径 1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到 250毫升/3升锥形瓶 或 80毫升/1升锥形瓶的 SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.-8-3.在18度150-25

14、0RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度.4.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟5. 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体6.去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟7.再次离心回收菌体8.用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.10.在液氮或-80度保存.附件2.小木虫 发布的高效感受态细胞的制作小木虫网站所有，供大家参考。作者: noah方法一A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配

15、，配后不需灭菌；C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121高压灭菌备用。取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。划线得到单菌落,37培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100mlSOB 培养基的三角瓶,37300rpms3-4小时, 将培养温度调至18剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4mlTB280ml（可用国产分析纯），混

16、匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。用纱布将所有装有-9-感受态的 EP 12小时以上。取出感受态放入-70超低温冰箱备用。 10*8 10*9贵材料的连接转化。洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过 2500g,建议 1500-2000g 5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴 220-30现。预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置 1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至 20ml，效果

17、不错。关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将 LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的 EP做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。 1010要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于 1990年gene上刊登的由 Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。 GLP可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。1必讲的，毋庸置疑。-10-2谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。3

18、 pH pH值并非单指配置或灭菌后的 pH整个摇瓶结束后的 pH pH值在 6.8-7.2以测一下 pH 6.0 6.5生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。4 OD OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调 OD不得大于 0.60.8OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在 OD值的两方面影响中找一个平衡点。5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的 Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用 20mMMgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前 20-30分钟加入，会收到很好的效果。6可以获

19、得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。7DMSO的效率增加。8 12只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。方法二1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在 LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.2.挑直径 1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到 250毫升/3升锥形瓶 或 80毫升/1升锥形瓶的 SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.3.在18度 150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高

20、于37度.4.OD600约 0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却 10分钟5. 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体6.去掉上清后, 用 1/3体积的冰冷 TB溶液悬浮, 在冷 10分钟7.再次离心回收菌体8.用 1/12.5体积的 TB悬浮, 添加最终浓度为 7%的 DMSO, 10分钟9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.10.在液氮或-80度保存.方法三（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在 LB平板上，37培养活化。（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于 SOC液体培养基，18，200-250rpm培养。（3 OD600=0.5-0.8 40mL离心管于 48000rpm

21、离心 10min，收集菌体。-12-（4）用预冷的 TB Buffer重悬菌体，4，8000rpm离心 10min，收集菌体。（5）重复第 4步操作。（6）用 8mL预冷的 TB Buffer重悬菌体，缓慢加入 DMSO至终浓度 7% 。（7）冰浴 10min后，分装保存于液氮中。本法效率极高,建议大家采纳方法四1. 单菌落2ml LB 37度 120RPM过夜1%37度 200RPM2小时(OD到 0.40.5)2.2ml, 冰浴15min,4度,6000RPM5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴 20min3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于 20

22、0ul 0.1MCaCl2中, 冰浴 30min建议用 TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。方法五E.coli感受态细胞制备方法:单菌落平板至 2ml LB, 37 250 r/m, 1ml 转至 50 ml LB, 37oC 250 r/m至A600=0.2-0.4离心后用 10毫升 TSS重悬后,分装 -70oC保存。尽量冰上操作.-13-转化: 加质粒(5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42 90秒，冰上2分钟，加LB至1ml, 37 1小时后铺抗生素平板。TSS:7.0ml pH6.1 LB2.0ml 50% PEG60000.5ML dm

23、so0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)0.3ml ddH2O枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化以枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）为例枯草杆菌化学感受态制备及转化方法1.准备新鲜的168LB37C培养箱培养12 h；2.转化前一天晚间挑单菌落至3 LB 37C250 r/min 培养过夜；3.第二天上午取160 l培养液转接至8 SPI 培养基中，37C，250 r/min 培养至对数生长末期(168 约4-5 h)；4.取0.2 生长至对数期末的培养液至2 SPII 37 C100 r/m

24、in培养90 分钟；-14-5.在上述 SPII 培养基的菌体中加入 20 l 10mmol/L ，再于 37C，100r/min 培养 10 分钟；6.将上述处理后的菌液分装成 0.5 5 l （DNA 量不能过高，不超过 5g 37 C，250 r/min 培养 90 分钟，取菌液涂布筛选平板。相关试剂配方如下：SP 盐：0.2%( NH ) SO ,4241.4% K HPO ,240.6% KH PO ,240.02% MgSO 7H O,420.1% 柠檬酸钠; (100)：2 % Casamino acid，10%酵母膏。SPI 培养基：SP 盐溶液加入 1 %体积浓度为 50%1

25、 %体积 100溶液；SPII SPI 培养基加入 1 %体积 50 mmol/LCaCl 1 体积 250 mmol/L2MgCl 溶液。2z 试剂SPASalts Solution500 Solution）0.4 (NH ) SO2g4 242.8% K HPO 3H O14g6g2421.2% KH PO420.2% Citrate Dihydrate 1g121灭菌 20min-15-SPB Salts Solution500 Solution）0.04% MgSO 7H O0.2g42121灭菌 20min100 Solution100 Solution）2Casamino acid

26、 Extract2g1010g121灭菌 20minSPI Medium20 mL）9.8mL SPASalts Solution9.8mL SPB Salts Solution200L （1）Glucose（50w/v， 20min）200L （1）100 SPII Medium6 mL）5.88mLSPI Medium60L （1）50mMCaCl260L （1）250mM MgCl2100Solution10mmolL NaOH 至pH8.0注意：1. 注意仪器用品的干净和无菌；2. 8ml SPI 培养基要放于 50ml 玻璃试管；3. 注意测定 值，一定要等菌体生长至对数期后期；4.

27、 保证菌体的浓度，可以提高转化率。-16-农杆菌感受态细胞的制备及转化参考帖子：/viewthread.php?tid=72/redirect.php?tid=1056&goto=lastpost-17-酵母感受态细胞的制备及转化有关毕赤酵母的相关资料：毕赤酵母表达操作手册（精译版）/viewthread.php?tid=17&extra=page%3D1毕赤酵母表达实验手册(丁香园版)/viewthread.php?tid=34&extra=page%3D1毕赤酵母表达手册英文原版/viewthread.php?tid=19&extra=page%3D2Pichia pastoris 完整操

28、作手册/viewthread.php?tid=2136&extra=page%3D2更详细、全面的有关酵母的资料请去：/forumdisplay.php?fid=26以毕赤酵母为例说明其感受态细胞制备及转化。对于毕赤酵母的转化目前有 4 种方法：1.锂盐法；2.PEG 法；3.原生质体法；4.电穿孔法。锂盐法和 PEG 法方法简便，但效率很低，每微克 只有几十个转化子或更低，一般不多用。原生质体法和电穿孔法转化率都较高，且一般可得到高拷贝5重组，其转化率都可达到 10 /g。但因原生质体法操作繁琐费时，所以简便、快速、高效的电穿孔法是理想的转化方法。对以上几种方法分述如下：-18-毕氏酵母氯化

29、锂转化法1.试剂1M 50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA/（ pH8.0, 1.0mM -20保存PEG3350 可屏蔽高浓度 LiCl 的毒害作用；2.感受态毕氏酵母的制备1. 接种 Pachia pastoris 到 YPD30 2428h养到 值为0.81.0（约 108 Cells/ml2. 收获细胞，用 25ml 无菌水洗涤一次，室温下 1500g 离心 10min；3. 重悬细胞于 100mM LiCl 溶液中，将悬液转入 1.5ml 离心管；4. 离心机最大速度离

30、心15 400ul 100mM LiCl溶液中；5. 按 50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；3.毕氏酵母的转化1. 煮沸 1ml 鲑鱼精 DNA5min，迅速冰浴以制备单链担体 ；2. 将感受态酵母菌离心，以 去除残余的 LiCl 溶液；3. 对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350240ul36ul25ul50ul1M LiCl2mg/ml 单链 Salmon spermDNA510ug/50ul H2O 质粒 DNA4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约 1min5. 30水浴孵育 30min；-19-6. 42水浴热休克 2025min;7

31、. 60008000rpm离心收集酵母菌体；8. 重悬酵母于 1mlYPD 培养基，30摇床孵育；9. 14h 后， 取 25100ul 30培养 23天鉴定；毕氏酵母 PEG1000转化法1.试剂缓冲液 1.0M Sorbitol Bicine（sigma（v/vethylene glycol缓冲液 B：40%（w/v）PEG1000（sigma0.2M Bicine，pH8.35缓冲液 C：0.15M NaCl，10mM BicinepH8.35未污染的新鲜、试剂级 DMSO，-70保存!注：1. 缓冲液 、B、C均用滤膜过滤，-20保存;2. 将 直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之

32、处（即使在冰上解 品的转化，建议按 6 样品/组进行）2.待转化毕氏酵母的制备1. 接种环接种 Pachia pastoris 于 YPD 平板，30培养 2d;2. 挑取单克隆酵母菌株于 10mlYPD 培养基中，30振荡培养过夜；3. 取步骤 2 中小量菌液接种到 100mlYPD 值从 0.1 升到 0.50.8；4. 室温下 3000g 离心收集酵母菌体，50ml 缓冲液 A洗涤一次；5. 重悬菌体于 4ml 缓冲液 A 0.2ml/管分装于 1.5ml 管加入 ，混合后迅速于液氮中冷冻，6. -70保存3.毕氏酵母的转化1. 将约 50ug 线性化质粒 DNA 溶于 20ulTE -

33、20-中；加入担体 （40ug 变性超声线性化鲑鱼精 DNA）以获得最大转化率；2. 37水浴孵育 5min，中间混合样品 12 次；3. 取出离心管，加入 1.5ml 缓冲液 B，彻底混匀；4. 30水浴孵育 1h；5. 室温下 2000g 离心 10min 1.5ml 缓冲液 C 中；6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于 0.2ml 缓冲液 C 中；7. 将所有转化液铺于选择性平板，于 30孵育 34 天后，鉴定；毕氏酵母电转化法1.感受态细胞的制备 取 10ul菌液，接种于 200ml LB液体培养基中活化培养，37，200 ，1618 小时。取 100ul 菌液接种于 20

34、0ml 液体 LB 培养基中。 37，200 rpm，培养 1618 小时。 灭菌 500 离心管，4，4000 ，20 min。得菌体沉淀。弃上清，菌体用 10甘油重悬并洗涤。重复洗涤 3 次。 第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约 1ml 液体用于重悬菌体。 200ul 于灭菌 EP 5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置 5min。 将混匀后得 200ul 菌液移入电击杯中。 使用电击穿孔仪进行转化，设置为 电压 2500，时间 5 。 电击后，往电击杯中加入 800ul SOC 培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 EP 管中。37，150 rpm ，轻摇 4560 min。 取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的 LLBZeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37 培养 1216 小时。2.线性化质粒 对 Pichia 的转化取新鲜制备的（或70冻存的）感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻；-21-1) 将 100l 菌体移出至一新的无菌 Eppendo