流式细胞仪培训

1、流式细胞仪培训第1页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五主要内容 流式细胞仪概述 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪的应用 检测的一般步骤第2页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五 一、流式细胞仪概述 第3页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五流式细胞仪种类BD FACSVantageBD-Calibur Epics Altra第4页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五Epics Altra Beckman Coulter第5页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五流式细胞仪的定义 流式细胞仪是指，使细胞（或

2、其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。第6页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五 利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。 检测表面标记物 检测胞浆标记物 检测胞核内标记物 检测可溶性蛋白流式细胞术（FLOW CYTOMETRY）第7页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五流式细胞仪的基本结构前向散射侧向散射第8页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五流式细胞仪显微镜流动的

3、细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可以揭示细胞内部结构信息特殊的显微镜第9页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五 高速测定细胞，大样本计数 检测稀有细胞 多参数分析 自动化 细胞分选流式细胞仪的主要特点第10页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五 二、流式细胞仪工作原理 第11页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五流式细胞仪工作原理流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光电倍增管接收，之后转换

4、为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算处理。第12页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五仪器基本组成流路流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5105-1106个/ml光路光源滤片光电倍增管PMT HV电路放大电路HV及GAIN 增益A/D转换统计 计算机第13页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五流路Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid流动室第14页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星

5、期五流式细胞仪光路图Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (PE)620BP FL3 (ECD)675BP FL4 (PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流动室第15页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五激光配置488nm氩离子激光器633nm氦氖激光器大功率水冷紫外激光器第16页，共57页，2022年，

6、5月20日，1点30分，星期五光路 - 滤片特性长通滤片 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 允许一定带宽的波长通过当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 ，这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter)630 nm BandPass FilterWhite Light Source第17页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五光信号收集 光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。二色镜 1 2 3带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧

7、光第18页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五数据处理FSC SSC FL1 FL2 FL3对数 线性 线性 线性 对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果（面积，峰高，宽度）第19页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五颗粒度细胞大小流式细胞仪产生的信号非荧光信号第20页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五FL1 FITC,GFP(PMT2)FL2 PE (PMT3)FL3 ECD,PI (PMT4)FL4 PC5,APC (PMT5)荧光信号第21页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五细胞表面的抗原(或细胞膜

8、受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。原理第22页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五488nm空冷激光 ： FITC、PE、ECD、PC5、PI、7AAD、 PerCP 、EGFP 、EYFP 、AO 、TO 、Fluo3633nm空冷激光： APC、APC-CY7 、CY5 90-4水冷激光：UV（333-364nm） HOECHST 33342、DAPI 第23页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五 三、流式细胞仪应用 第24页，共57页，2022年，5月20日，1点

9、30分，星期五流式细胞仪应用 淋巴细胞免疫功能测定 干细胞研究 细胞增殖与凋亡检测 细胞周期及倍体分析 细胞活性分析 细胞分选 第25页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五淋巴细胞亚群活化的T淋巴细胞抗原特异性免疫细胞调控性T细胞树突状细胞先天免疫细胞细胞免疫功能测定第26页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五 细胞群 CD抗原 T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35

10、 NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 内皮细胞 CD105 CD106 CD109 细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126CD抗原及其相关细胞群第27页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低严重降低增高降低SARS

11、降低降低降低降低降低慢性活动性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低肿瘤降低降低增高降低降低第28页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五用荧光标记抗体抗体特异性地结合细胞上对应的抗原表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强阳性细胞百分比或浓度靶蛋白浓度第29页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测第30页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五造血系统干细胞肿瘤干细胞间充质干细胞神经干细胞脂肪干细胞干细胞研究第31页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五热门研究(肿瘤)干细胞肿瘤组织无限制

12、的增殖在于肿瘤干细胞的存在目前研究的肿瘤干细胞来源于前列腺、乳腺等肿瘤肿瘤干细胞数量稀少，常规方法很难检测目前研究发现，肿瘤干细胞和正常细胞在HOECHEST 33342染料摄取方面有重大差别故流式细胞仪是分析和检测肿瘤干细胞的重要工具第32页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五 干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST 33342染色时能将该染料泵出，因此分析不能被该染料染色的细胞群时可以发现一群不能染色的细胞既是干细胞，因此能够在众多肿瘤细胞中区分出肿瘤干细胞。肿瘤干细胞中的研究应用-Hoechst 33342 side population第33页，共57页，20

13、22年，5月20日，1点30分，星期五HoechstHoechst+Vera.Side Population Cells第34页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五细胞凋亡研究1. 鉴别凋亡与坏死: Annexin /PI2. 测定凋亡率:Annexin 、Apo 27、TUNEL3. 研究凋亡触发机制：Caspase、Fas及FasL bcl-2/bax4. 多参数分析凋亡是趋势第35页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五第36页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五G1S phaseG2MG112 1DNA含量 DNA 含量细胞周期时相G

14、0/1G2/MS细胞数细胞周期分析第37页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五PIEthidium BromideAcridine OrangeDAPI (UV excitable)Hoechst 33342 (viable, UV excitable)不能主动进入细胞，需要固定打孔488nm激发为脂溶性，主动进入细胞UV激发常用的DNA 染料第38页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五DNA含量及细胞周期分析 细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行

15、分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.第39页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五G0/G1SG2/M第40页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五流式细胞仪分选电荷式分选是当前的主流分选模式高速分选是保证结果的基本条件高纯度和高活性是分选的基本要求可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同的波长；真正的紫外）提供多种分选流动室光路稳定，紫外激光功率大流式分选和磁

16、珠分选的差别和联系第41页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector电荷式细胞分选第42页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五细胞分选的主要技术指标 分选速度： 25000个细胞/秒 分选纯度：98% 分选后细胞存活率：97%第43页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五Before SortingAfter Sorting第44页，共57页，2022年，5月20

17、日，1点30分，星期五 三、流式细胞仪检测的一般步骤 第45页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五设置检测方案（PROTOCOL)染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体）同型对照管调电压电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果检测的一般步骤第46页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五电压调节利用同型对照：设置背景电压 volts增益 Gain设定阴性和阳性信号强度的临界点第47页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五荧光补偿 Need to do when we measure signals from more t

18、han 1 fluorescence. FITC520BPPE575BP第48页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五4 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5第49页，共57页，2022年，5月20日，1点30分，星期五补 偿PEFITCPE+ cellsFITC + cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signalFor Pure PE+ cells,= FITC signal - % PE signalAfter compensationPEFITCPE+ cellsFITC + cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell = the Y-mean of -/- cellsX-mean of the PE cell = the X-mean of -/- cellsPEFITCPE+ cellsFITC + cellsOVER compensation第50页，共57页，2022年，5月