金丝桃素对慢性高眼压兔视网膜神经节细胞保护作用的组织学观察

1、金丝桃素对慢性高眼压兔视网膜神经节细胞保护作用的组织学观察【摘要】目的：探究金丝桃素对慢性高眼压兔视网膜神经节细胞的影响。方法：取成年家兔20只，后房内注射-糜蛋白酶，建立兔慢性高眼压模型。造模成功的兔眼在10d后玻璃体内分别注入金丝桃素0.1L或生理盐水0.1L，1次/k，连续2k。另用4只正常兔做空白对照。最后光镜电镜观察视网膜神经节细胞的构造变化及视网膜内层平均厚度的变化。结果：生理盐水对照组节细胞数量减少，部分严重变性，染色质边集,线粒体、内质网等细胞器严重肿胀,视网膜内层平均厚度变保金丝桃素治疗组节细胞形态构造较生理盐水对照组损伤细微,节细胞数量稍有减少,部分变性,染色质边集，线粒体

2、、内质网肿胀较轻。视网膜内层平均厚度轻度变薄,与生理盐水对照组相比有显著性差异(P0.01)。结论：金丝桃素作为一种特异性的蛋白激酶抑制剂，对慢性高眼压下兔视网膜神经节细胞有保护作用。【关键词】金丝桃素慢性高眼压视网膜神经节细胞神经保护兔ThehistlgybservatinntheprtetiveeffetfhyperiinnretinalganglinellinhrniularhypertensinrabbitsAbstratAI:Texplretheeffetfhyperiinnretinalganglinellinhrniularhypertensinrabbits.ETHDS:Ten

3、tyrabbitsereusedtbuildhrniularhypertensindelbypsterirhaberinjetinfalpha-hytrypsin.Tendaysaftersuessfuldelreatin,hyperiin0.1Lrsaline0.1Lasinjetedintthevitreusavityneaeekfr2eeks.Retinalganglinellftheseeyesandthatffurnralrabbiteyeserebservedbylightirspyandeletrnirspy.Thethinknessfinnerretinalayerasexai

4、ned.RESULTS:Thenuberfretinalganglinellinsaline-treatedgrupdereasedsignifiantly.Thereasseriuselldegradatinithperinulearndensatinfhratinandsellingrganelles,butthehangeasslightinhyperiin-treatedgrup.Thedifferenefthethiknessfinnerretinalayerbeteenthetgrupsassignifiant(P0.01).NLUSIN:Intravitrealinjetinfh

5、yperiinasaprtEinkinaseantagnistanprtettheretinalganglinellinhrniularhypertensinrabbits.KEYRDS:hyperiin;hrniularhypertensin;retinaganglinell;nerveprtetin;rabbits0引言青光眼是一组与眼压升高有关的致盲性眼玻它的病理根底是视网膜神经节细胞进展性死亡。目前青光眼的治疗主要是降眼压，但是单纯降眼压并不能阻止视功能的继续下降。随着视神经保护理论的提出和研究，视神经保护治疗越来越受到人们广泛的关注1。我们就是基于视神经保护治疗的理论，讨论一种蛋白激

6、酶prteinkinase，PK抑制剂金丝桃素对视网膜神经节细胞的保护作用。1材料和方法1.1材料安康成年家兔24只，体质量2.02.5kg，无眼疾，雌雄兼用，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。金丝桃素和二甲基亚砜(siga公司)、注射用糜蛋白酶上海第一生化药业、LZL-12型手术显微镜镇江中天光学仪器有限责任公司、Tnpen笔式眼压计edtrniSlan公司。1.2方法安康成年家兔24只，随机挑选20只作为实验组，另4只作为对照组。实验组用200g/L乌拉坦5L/kg，3in内注入耳缘静脉全身麻醉，每只兔随机选一眼作实验眼，的卡因点眼部分麻醉。用1L注射器抽取400U糜蛋白酶溶液0.

7、2L，从颞侧角巩膜缘进针，经瞳孔至对侧虹膜下注入后房，四环素眼膏涂眼。每日用Tnpen眼压计测眼压，眼压在30Hg1Hg=0.133kPa以上为慢性高眼压造模成功2。待高眼压模型眼压稳定升高10d后，随机挑选半数的高眼压兔作玻璃体内金丝桃素注射。金丝桃素用二甲基亚砜溶解，生理盐水稀释，终浓度为2l/L,避光保存。实验兔乌拉坦全身麻醉加的卡因部分麻醉，在显微镜下用2L注射器，从12点钟角膜缘后3处睫状体平坦部进针，抽出玻璃体0.1L，注入金丝桃素0.1L。1次/k，连续2k。另一半高眼压兔同上法操作，玻璃体内注入生理盐水0.1L。1次/k，连续2k。正常兔4只，不做任何眼部和全身的处理，处死后进

8、展下一步实验。第2次玻璃体注射后7d处死兔子，摘除眼球置于冰盒内，迅速去除眼前段，暴露并别离视网膜分别制作光镜电镜标本。光镜标本经40g/L福尔马林固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察并照相3。电镜标本经30g/L的戊二醛和10g/L的锇酸固定，乙醇丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀柠檬酸铅染色，电镜观察并照相4。观察所有家兔视网膜光镜下构造的变化并利用定量病理学的网格系统5，按J=LPPb/IA+Ib，计算视网膜内界膜至外核层内侧间的间隔 ，以5次平均值(TIRL)作为视网膜内层平均厚度6。统计学处理:应用SPSS11.0统计软件进展统计学处理,结果用表示2结果

9、我们采用后房注射糜蛋白酶的方法制备兔慢性高眼压模型。此方法高眼压发生快、持续时间长、眼压稳定。采用20只兔作为实验组造模，最终16只成功，其中一只因麻醉过量死亡，3眼压未到达预期程度，成功率为80%。造模后眼压一般在术后1k内升高，实验眼呈牛眼状外观，眼球变硬,睫状充血,角膜水肿，前房加深，瞳孔散大。Tnpen笔式眼压计测得平均眼压为(34.122.31)Hg,高眼压状态至少可维持2。2.1光镜观察光镜下见正常兔的视网膜组织构造明晰、完好，可观察到10层构造，外核层细胞数量最多，内核层细胞数量较少，节细胞为单层，形态呈类圆形图1A。生理盐水对照组视网膜内层变薄，神经节细胞数量明显减少，细胞出现

10、变性，内、外核层细胞排列稀疏，数量减少图1B。金丝桃素治疗组损伤明显轻于生理盐水对照组，神经节细胞数量有所减少,胞核大部分存在，部分出现空泡样变，内核层和外核层构造与正常组所见相似图1。2.2电镜观察透射电镜下见正常视网膜神经节细胞核呈类圆形，染色质颜色明晰，分布均匀，内质网、线粒体等细胞器形态正常，细胞膜完好(图2A)。生理盐水对照组神经节细胞明显减少，部分细胞严重变性，核构造稀疏，核仁固缩及偏位，胞质染色质边集，内质网肿胀，线粒体肿胀，嵴消失，空泡变性图2B。金丝桃素治疗组见部分核稍有变形，核染色质略显稀疏,颜色稍淡,线粒体空泡变性,残存线粒体嵴,内质网仅见轻度肿胀图2。视网膜内层平均厚度

11、正常组为78.621.87,金丝桃素治疗组为73.805.61,生理盐水对照组为59.302.17。后两者相比有显著性差异(P0.01)。图1兔视网膜神经节细胞(HE200)A：空白对照组正常；B:生理盐水对照组数量明显减少，出现变性；：金丝桃素治疗组数量减少,胞核大部分存在图2兔视网膜神经节细胞超微构造(TE106)A：空白对照组核居中,细胞器形态正常,细胞膜完好；B：生理盐水对照组核仁固缩，胞质染色质边集，线粒体、内质网等细胞器肿胀；：金丝桃素治疗组核染色质浓集,线粒体空泡变性,残存线粒体嵴3讨论在临床上作为一种抗病毒药、抗抑郁药应用的金丝桃素是一种PK的特异性抑制剂，是从金丝桃家族中提取

12、的一种紫色结晶颜料7。目前已经有研究说明，金丝桃素对增生性玻璃体视网膜病变也有治疗作用8。通过本实验我们观察到，应用金丝桃素玻璃体内注射，视网膜神经节细胞的形态构造相比生理盐水对照组损伤明显减轻，视网膜内层平均厚度也比生理盐水对照组厚。这说明金丝桃素可以直接增强节细胞对抗有害因素的才能，促进受损细胞的存活和功能恢复。青光眼的主要危险因素之一是病理性眼压升高。慢性高眼压对视网膜神经节细胞损伤的机制主要是因为眼压升高迫使筛板组织变形，使得节细胞轴浆流受阻于筛板，由此引起逆行运向神经节细胞胞体的神经营养性因子减少，神经节细胞释放谷氨酸，细胞外间隙谷氨酸蓄积，节细胞发生凋亡9-12。本实验中生理盐水对

13、照组节细胞数量明显减少,部分严重变性,核仁固缩，胞质染色质边集，线粒体、内质网等细胞器肿胀就是细胞凋亡的早期表现。PK是一类钙、磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它可以通过一系列信号级联反响对谷氨酸受体和谷氨酸转运蛋白进展具有浓度和剂量依赖性的调节，使得细胞外间隙谷氨酸蓄积的同时，增强谷氨酸与其受体的作用，最终增加受体介导的兴奋毒性，导致视网膜神经节细胞的凋亡13,14。反之，PK抑制剂那么可拮抗这一作用。我们已经用实验证实了慢性高眼压兔不同时间点的视网膜谷氨酸含量都比正常值有所升高，而PK抑制剂金丝桃素能拮抗这一作用。金丝桃素对视网膜神经节细胞组织学的保护作用，很可能是通过PK抑制剂对视网膜

14、谷氨酸含量的抑制这一机制来实现的。当然对于青光眼这种慢性疾病来说，反复玻璃体内注射，也是有其明显的不良后果的。因此，讨论金丝桃素的作用和调控机制，研究如何发挥其对青光眼视神经保护的治疗潜力，有待于我们今后进一步研究。【参考文献】1王艳.青光眼视神经保护治疗的实验研究.眼科新进展,2002;22(3):16-182SearsD,Sears.Bld-aqueusbarrierandalpha-hytrypsinglauainrabbits.AJphthall,1974;77(3):378-3833项敏泓,钟一声,张兴儒.灯盏细辛对兔高眼压视网膜神经节细胞活性的作用.眼科新进展,2022;25(5)

15、:414-4164原慧萍,褚利群,王莉娜,王雅.兔实验性高眼压视网膜神经节细胞的凋亡.眼科研究,2022;22(2):180-1825申洪,沈忠英,主编.实用生物体视学.广州:中山大学出版社,1991:113-1146TakahashiK,LaT,EdardP,BuhiRTs.Prtetiveeffetsfflunarizinenisheiinjuryintheratretina.Arhphthall,1992;110:862-8707AgstinisP,AssefaZ,VantiegheA,VandenheedeJR,erlevede,ittePDe.Appttiandanti-apptti

16、signalingpathaysinduedbyphtdynaitherapyithhyperiin.AdvEnzyeRegul,2000;40:157-1828高前应,惠延年,王雨生.金丝桃素抑制兔外伤性增生性玻璃体视网膜病变.眼科学报,2002;18(4):240-2459王建洲,贺翔鸽,谢琳,岳红云,孙亚丽.Ng蛋白在正常大鼠视神经视网膜的表达.国际眼科杂志,2022;6(6):1302-130410石晶明,蒋幼芹.兴奋性氨基酸与青光眼.国际眼科杂志,2022;4(4):668-67411QuigleyHA.Ganglinelldeathinglaua:pathlgyreapitulatesntgeny.AustNZJphthall,1995;23(2):85-9112崔志利,康军,王琳,王静,惠延年,胡丹.神经营养因子影响视神经夹伤后视网膜GAP-43RNA表达变化.国际眼科杂志,2022;5(5):902-90613LanJY,