血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞损伤的实验研究

1、血管告急素诱导肾小管上皮细胞损伤的实行研究张建鄂,罗昌霞,张庆红,李涛摘要目的:研究血管告急素诱导肾小管上皮细胞损伤的机制。要领:血管告急素10-7l/l参加肾小管上皮细胞为比拟组；体外造就的肾小管上皮细胞作为空缺比拟；差异浓度缬沙坦10-6l/l、10-7l/l、10-8l/l、10-9l/l先与肾小管上皮细胞配合造就半小时后再参加血管告急素10-7l/l为干预组；ESA、RT-PR别离检测差异时限NF-B活性、骨桥卵白RNA表达。效果:血管告急素可诱导肾小管上皮细胞内NF-B活性增长，骨桥卵白RNA表达上调；而差异浓度缬沙坦干预组检测效果表现NF-B活性、骨桥卵白RNA表达显着下调。结论:

2、血管告急素诱导肾小管上皮细胞损伤与导致肾小管上皮细胞内NF-B活性增长、骨桥卵白RNA转录上调有关。这一历程大概依靠血管告急素型受体。关键词血管告急素;肾小管上皮细胞;核转录因子-B;骨桥卵白Abstrat：bjetiveTexplretheehanisfangitensininduingtheinjuryfprxialtubularells.ethdsulturedellsereinubatedithAngitensin10-7l/lasthentrl;ulturedellsereinubatedithdifferentnentratinXiesartanfrhalfanhurandthen

3、ithangitensin10-7l/lastheinterventingrup;prxialtubularellsithutstiulatinasblankntrl;ESA,RT-PRereusedtbserveNF-BativityandPNRNAexpressinindifferentperids,respetively.ResultsAngitensinuldinreaseNF-BativityandupregulatePNRNAexpressininprxialtubularells.hileXiesartanulddereaseNF-BativityanddnregulatePNR

4、NAexpressininangitensinstiulatedprxialtubularells.nlusinTheehanisfangitensininduingtheinjuryfprxialtubularellsisrelatedtinreaseNF-BativityandupregulatePNRNAexpressin,andthispressisangitensinreeptrdependent.Keyrds:Angitensin;Prxialtubularell;NF-B;PN比年来，肾脏局部肾素血管告急素醛固酮体系RAS在慢性肾脏病的产生、生长中的紧张作用越来越受到人们的存眷。

5、RAS的重要效应因子血管告急素Angitensin已创造与很多肾脏疾病的产生、生长历程严密相干。但血管告急素可否诱导小管上皮细胞损伤及其详细机制不明。本课题通过体外实行用必然浓度血管告急素刺激肾小管上皮细胞，不雅察核转录因子、细胞因子的变革，探究血管告急素诱导肾小管上皮细胞损伤的大概机制。1质料与要领1.1重要试剂及仪器测定NF-B活性的ESA试剂盒prega公司；血管告急素siga公司；RT-PR试剂盒BDBisiene公司；TRIZLGiB公司；RNaseA按捺剂Nvagen公司；引物上海生工生物工程技能公司；大鼠的肾小管上皮细胞株(NRK细胞)购至中科院上海细胞库；冷冻离心机Bifuge

6、公司，二氧化碳温箱Frasientifi公司。缬沙坦由北京诺华公司提供。1.2细胞造就无菌条件下大鼠肾小管上皮细胞株，0.25%胰酶消化2in，不雅察细胞疏散成拉网状，停顿消化，参加RPI1640造就液含20%胎牛血清，300g/l谷氨酰胺、青霉素、链霉素重复吹打，并分装至造就皿，置于37二氧化碳温箱中孵育；重复传代，取第七代细胞实行用。1.3实行分组当传代细胞长至90%融适时换无血清造就液继承造就12h。试验分组如下：空缺比拟:未加刺激物的造就细胞。比拟组:血管告急素10-7l/l参加造就细胞，别离于12、24h检测NF-B活性；12、24h检测骨桥卵白RNA表达程度；每个检测指标均设五个重

7、复组。干预组:差异浓度缬沙坦10-6l/l、10-7l/l、10-8l/l、10-9l/l参加造就细胞，半小时后再参加血管告急素10-7l/l，别离于12h检测NF-B活性；12h检测骨桥卵白RNA表达程度；每个检测指标均设五个重复组。1.4ESA的操纵步调核卵白的提取Bradfrd法定量。ESA的操纵依试剂盒说明书at#3050举行NF-B寡核苷酸探针r-32pATP标识表记标帜及ESA法测定NF-B活性。NF-B同序寡核苷酸探针序列为3-TAATTGAAAGGGTG5；5-AGTTGAGGGGATTTAGG-3。反响竣事后，在4%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳2h电压150V，电泳缓冲液为0.

8、5TBE。电泳完毕后干胶，-70放射自显影。电泳效果经密度扫描仪举行半定量阐发。1.5骨桥卵白的RT-PR操纵步调造就细胞接种至12孔造就板，当细胞长至80%90%融适时换无血清造就液，12h后按试验分组加药物干预，每组细胞均设五个复孔。TRIZL提取总RNA，并测定浓度及260/280n的吸光度A值。按T1TANIUTne-stepRT-PR试剂盒说明举行操纵。反响条件：501h，905in；9430，6530，681in30个循环；68延伸2in，4保存。骨桥卵白上游引物序列：5AAGTGAATTAGAA3；骨桥卵白卑劣引物序列为：5GAATGGGATGATTGAT3，产物长度446bp；

9、设-atin为内参照，其上流引物序列为5-TGTAATGGATTGTGA-3，卑劣引物序列为5-TTGTTGTGATAAT-3，产物长度545bp。ark片断选用2000bp。电泳阐发:取8lPR扩增产物于质量浓度为1.5g/l的琼脂糖凝胶上电泳，接纳kdaksieue凝胶图像阐发体系扫描，并阐发电泳条带，以PN与-atin的电泳条带光密度比值来作为PNRNA的相对表达量。1.6统计学处置惩罚全部实行数据接纳均数尺度差xs表现，差异的明显性接纳单因素方差阐发及q查验，以P0.05为差异有明显性。2效果2.1ESA法测定效果(见图1)图1中17泳道的密度扫描值依次为：36.308.73,194.

10、5010.45,186.3012.30,76.344.57,90.345.86,114.607.67,138.416.53；n=5每组细胞均设五个重复组。未加刺激的肾小管上皮细胞内NF-B表达较弱；血管告急素10-7l/l刺激肾小管上皮细胞后NF-B活性显着增高，以12h最显着，为空缺比拟的5.47倍P0.05；24h为空缺比拟的4.97倍P0.05；差异浓度缬沙坦12h可按捺血管告急素刺激的肾小管上皮细胞内NF-B活性，按捺作用依次为10-6l/l10-7l/l10-8l/l10-9l/lP0.05。图1各组NF-B活性的变革略注:1.空缺比拟；2.血管告急素10-7l/l12h；3.血管告

11、急素10-7l/l24h；4、5、6、7泳道别离为10-6l/l12h、10-7l/l12h、10-8l/l12h、10-9l/l12h；2.2骨桥卵白RT-PR检测效果(见图2)17泳道PN与-atin的电泳条带的光密度比值依次为：17泳道依次为0.200.05，0.970.049，0.850.014，0.170.032，0.370.017，0.600.031，0.280.012；n=5；颠末统计学阐发，各组及组间比拟均有明显差异，P0.05。从效果阐发：未加刺激的肾小管上皮细胞内骨桥卵白转录较弱，而血管告急素10-7l/l诱导肾小管上皮细胞内骨桥卵白转录增长，12h达岑岭，并连续至24h；

12、差异浓度缬沙坦可按捺血管告急素刺激的肾小管上皮细胞骨桥卵白的转录程度，按捺作用依次为10-6l/l10-7l/l10-9l/l10-8l/lP0.05。图2各组PNRNA程度的变革略注：:DNAark；1、空缺比拟;2、血管告急素10-7l/l12h；3、血管告急素10-7l/l24h；4、5、6、7泳道别离为缬沙坦10-6l/l12h、10-7l/l12h、10-8l/l12h、10-9l/l12h。3讨论肾脏局部肾素血管告急素醛固酮体系RAS在慢性肾脏病希望中的作用已倍受器重，血管告急素转化酶按捺剂和血管告急素受体拮抗剂应用临床及动物实行研究证明，血管告急素在小管间质病变中发挥紧张作用1。

13、比年来，大量研究效果表白2，肾小管间质病变较肾小球病变动严密相干于肾成效的损伤和预后。小管间质病变在举行性肾小球损伤中的紧张性已经被越来越多的国表里学者所器重。在小管间质损害历程中肾小管上皮细胞饰演着紧张的脚色。但血管告急素诱导肾小管上皮细胞损伤的详细机制不明。NF-B作为一种紧张的核转录因子，能与多种基因启动子或加强子上的B位点产生特异性结合，并促进基因转录，到场很多基因，尤其是炎症与免疫相干基因的表达与调控。很多刺激，如：肿瘤坏死因子TNF-、高糖、血小板活化因子、细胞因子等可激活NF-B3。NF-B游离并移入核内,调控炎症与免疫相干的基因的表达。在胞浆中还存在另一种卵白质家属-IB，它的

14、重要作用是与NF-B/Rel卵白在胞浆中结归并使后者保持静息状态。NF-B在核内与新合成的IB结合后出核，进入胞浆，从而失活。本课题通过体外实行用血管告急素10-7l/l刺激肾小管上皮细胞，ESA检测效果表现NF-B活性升高，12h达岑岭，并连续至24h，说明必然浓度血管告急素可诱导肾小管上皮细胞NF-B活性升高，与随后的炎症、纤维化基因的过分表达严密相干。骨桥卵白是一种可以在肾小管上皮表达的高度酸化的磷卵白，现以为它是巨噬细胞趋化因子。而在很多病肾实行模子上包罗缺血再灌注损伤创造其表达上调。如今针对临床肾脏疾病的研究创造骨桥卵白在伴有卵白尿的肾小球疾病如微小病变性肾并膜性肾并IgA肾病的肾小

15、管上皮细胞处高表达，均与小管间质纤维化严密相干4-5。本研究通过体外实行用血管告急素10-7l/l刺激肾小管上皮细胞，RT-PR效果表现配合造就后骨桥卵白的转录增长，在12h达岑岭并连续至24h，与血管告急素10-7l/l诱导肾小管上皮细胞内NF-B活性改变一样等，证明血管告急素10-7l/l可诱导肾小管上皮细胞内骨桥卵白的转录增长，这大概与肾小管间质巨噬细胞浸润有关。通过对差异浓度缬沙坦配合造就的肾小管上皮细胞的测定，在雷同刺激下其NF-B活性及骨桥卵白的转录程度显着低落，从实行角度说明缬沙坦用于慢性肾脏病的治疗机制与按捺血管告急素诱导的肾小管上皮细胞内NF-B活性及骨桥卵白的转录程度有关，

16、因缬沙坦属血管告急素型受体拮抗剂，我们推测血管告急素诱导肾小管上皮细胞NF-B及PNRNA活性上调依靠于血管告急素型受体。通过本研究证明血管告急素可诱导小管上皮细胞内NF-B活性显着增长，骨桥卵白转录增长，与炎性细胞小管间质浸润严密相干，而且这一历程依靠AGN型受体。但详细的信号转导途径仍需深化研究。参考文献1LaiKN,hanLY,TangS,etal.esangialexpressinfangitensinreeptrinIgAnephrpathyanditsregulatinbyplyeriIgA1J.KidneyInt,2022,66(4):1403-1416.2DruK,BauerB

17、,FreudingerR,etal.AlbuininduesNF-kappaBexpressininhuanprxialtubule-derivedells(IHKE-1)J.ellPhysilBihe，2002,12(4):187-196.3TitaN，rishitaR，TitaS,etal.InhibitinfTNF-alpha,induedytkineandadhesinleule:expressininglerularellsinvitrandinvivbytransriptinfatrdeyfrNFkappaBJ.ExpNephrl,2001,9(3):181-190.4KairiJY,Ta