Sequenom-SNP实验过程说明

1、SequenomSNP实验过程说明文件目录一、实验基本流程及原理（1二、实验过程（21、引物设计（22、DNA提取（33、PCR扩增（34、PCR产物碱性磷酸酶处理（35、单碱基延伸（46、树脂纯化（57、芯片点样（58、质谱检测（5三、附录实验所需的试剂、耗材和仪器设备（5一、实验基本流程及原理SequenomMassARRAYSNP检测过程结合多重PCR技术、MassARRAYiPLEX单碱基延伸技术,和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflight,MALDI-TOF进行分型检测。

2、将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩增，再使用特异的延伸引物与PCR产物进行单碱基延伸反应。由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差异,因此由SNP多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现，通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术，检测延伸产物分子量的大小,应用专用的分析软件，通过判断分子量的差异而进行SNP分型检测。SNP检测实验基本步骤如下图所示：图1SequenomMassARRAYSNP检测实验基本步骤二、实验过程1、引物设计使用Sequenom公司GenotypingTools及MassARRAYAssayDesign软件设计

3、待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并交由生物公司合成。2、DNA提取使用WizardGenomicDNApurificationKit(Promega或NucleoSpinTissue(MN等试剂盒或类似产品，提取组织、细胞或血样中的DNA。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/pl，转移至384孔板,-20C储存备用。P書旷壇采用多巫pfR披朮，三酸汕皈申进讦,莓吓反应悴察总憚磁勺11.(1在一牛新酌l.nlFP管中SSdPCRmastermbt潜鶴就剧PCR应去阳mix蓿：PCSMIX诃超卒圧J3.

4、mLlOPCRBjffier0.5MCiJ(25inNJ04dNrPmixOSmM)C.lHotSarTitkJjpU0.1Watei-I.QPCft口FiVfkFm(3K1TotalVolumeA:D港用24通道柚權哉.閤节枷堆林为H了64扎西的毎牛仙抹九冲咖入KinaEtormixSi.谟3frlfL極即対PR廃J0複.1取出已啞剖卷肝旳DM几祥品1&4JL使册岀谨迢加徉韶嗣书加祥悴和盂呻1每个寧叱III技酣系中包誡悔DMA?S-50ng.日址曲丁鬥亦U,每亲扩引物O.Slimol.OlplZSmMdHW(4fiJ树孑师的PCRft上彊运PCW反应焙件为创匚4归种.的C2Q妙上M秒72C1

5、分肿，45亍區环：7于：占分神：4豐阳特.垮占84孔PC匕辰阪曲宜亍PCR仅上，启动PCR疑止，4、PCR产物碱性磷酸酶处理(1在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimpalkalinephosphatase,虾碱性磷酸酶处理,以去除体系中游离的dNTPs。(2配制碱性磷酸酶处理反应液,SAPMix。SAPMix对每个反应,口1Water1.53SAPBuffer(lOx)0.17SAPEnzymeJl?JU/ul)03TotalVolume(3使用24通道加样器，调节加样体积为2pL,将SAPMix加入384孔PCR反应5APM&,plWalt-i1.55SAPBuFlerCIO

6、if0.1T5AFfftzymt-(1.7U/dI)0-JTbtalVAolurm2淘般2pl(SAP0,5U.bufferDQ斛打3S4fLfeiSH在誥旨3B4锁昭代R仅上,iSSPCR痰IS泰忡37X40#巧毡弓分仲：4X14.启动PCR惶进厅硏性隣酸陶肚理.L单说基延惮(1)旺翩期皈圉屮结康后.逬行单髓拙忡应两.饭府噸.鼬廨?Ml(2配到单谨封延咽蓝国直.EJCTEI4DMx.EXTENDMix2施t良Ei.pLWaterE?tt?nprimerVHJ即2仲l：rLEXeuFrrpltis02IPVE5(CuminaTorD2JFlfXenzyme0.04讪日tfaliirne2(4将

7、384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件:94Cfor30seconds94Cfor5seconds52Cfor5seconds80Cfor5secondsGOTOIII,4moretimesGOTOII,39moretimes72Cfor3minutesVII.4Cforever启动PCR仪进行单碱基延伸反应。6、树脂纯化(1将CleanResin树脂平铺到6mg的树脂板中;(2加16卩1水到延伸产物的对应孔内；(3将干燥后的树脂倒入延伸产物板中,封膜,低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触；(4离心使树脂沉入孔底部。7、芯片点样启动MassARRAYNanodi

8、spenserRS1000点样仪,将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom芯片上。8、质谱检测将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeoffligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析,检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom分型并输出结果。三、附录实验所需的试剂、耗材和仪器设备关键试剂CodeReagentsManufacturerCatNo.1CompleteiPLEXGoldGenotypingReagentSet384Sequenom10148-2关键仪器CodeInstrumentsManufacturer1S1000TMThermalCyclerBIORAD2PipettesinglechannelEpp