核酸探针技术及应用

1、核酸探针技术及应用 生物学的进展，应用DNADNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最 常用的方法， 目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上争辩发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段 介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。一、核酸探针技术的原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。核酸探针技术是将双链DNAAT，GC碱基配对的原则重组合成双链为复性。这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或局部互补(局部同源)的条件下才能实

2、现。正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进展杂交，(另一条DNA或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或局部同源的DNA(或RNA)存在。由于探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。二、核酸探针技术的根本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNADNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。再加上DNAx影印者即为阳性。探针亦可用3H标记，最终用液

3、闪计数器计致。还可用生物素，抗生物素等标记，最终用酶标法显色，均能得到满足效果。核酸探针的制备核酸探针可分为DNACDNARNA法也不同。DNA探针DNA探针可分为基因探针和基因片段探针。全基因组基因探针的制备最简洁，只要将染色体DNADNA用限制性内切酶酶(Ecoli)，筛选含特异目的基因片段的克隆株进展扩增，再提取基因片段作探针。CDNA探针通过提取纯度较高的相应mRNA或正链RNA病毒的RNA， 反转录成CDNA作为探针。也可以进一步克隆在大肠杆菌中进展无性生殖，再从重组质粒中提取CDNA作探针。RNA探针有些双链RNA病毒的基因组在标记后， 可直接用作探针。另一种是从CDNA 衍生而来

4、的RNA探针， 可由很强的RNACDNA探针所不及， 由于RNARNA复合物比DNARNA复合物稳定，所以其灵敏度可提高10倍以上。寡核苷酸探针用DNA合成仪可以合成50个核苷酸以内的任意序列的寡核苷酸片段，以此作为核苷酸探针，也可将它克隆到M 系统中使之释放含探针序列的单链DNA，使探针的制备和标记简化。13核酸探针的标记核酸探针过去承受放射性同位素进展标记，常用标记物有32P dNTP，35S dNTP等。同位素的选择是依检测类型而定，制就的DNA探针先经加热变性成单链后再与固定于硝酸纤维素膜上的待测DNA杂交，如为同源则与之结合，经放射自显髟后，膜上消灭黑色区。放射性同32P代替磷原予不

5、转变碱基空间构造，所以不影响杂交反响的动力学曲线。其缺点是半衰期短射性物质有金属(如汞)，半抗原(如地高辛)，生物素。 和酶等，应用较多的是生物素。非放射性标记的特点是保存时问长， 检测时使用便利，其最大缺点是灵敏度一般比放射性同位素低，但最近报道用化学发光物吖啶酯直接标记DNA探针，用化学发光仪检测杂交体，其灵敏度超过放射性同位素标记的探针可能是将来核酸探针分析技术的进展方向。在这里介绍一种非放射性标记“生物素核酸探针” ，其根本原理为：生物素(Biotin)是一种B族维生素，能与抗生素蛋白亲和素(Avidin)或链霉亲和素(Streptavidin)特异性结合，其解离平衡常数(K10-5D

6、。每个生物素分子由四个一样亚基组成，每个亚基都能专一性地识别一个生物素分子的脲基环局部被生物素所标记的目标，然后检测荧光或酶反响而检待测目标。标本处理首先从标本中提取DNADNA可用DNA用一支包装的小柱于30分钟内快速提取DNA的仪器。标本经快速过柱后，到达纯化，DNA 加热变性使成单链 (RNA是单链勿需予先变性)实行标本可能是未知病原体悬液粪便标本等。目前已进展了不需抽提核酸而直接在细胞裂解液中进展检测的方法DNA分且简洁把握，国外在爱滋病的病毒检测中已应用这种方法对血细胞进展处理。样品处理要考虑的另一个问题是待测样品中目的序列的含量或总的核酸量 低必定会影响检测的灵敏度。解决的方法是用

7、聚合酶链式反响(PCR)的方法，它能在体外通 过DNA 聚合酶将目的序列的拷贝数特异地快速扩增1O5107倍，使标本中目的序列的含量大PVCR法已广泛应用于DNA 传染病的早期诊断和法医物证鉴定中均取得了满足的结果。核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid bybridization)是指标记的单核苷酸和所需检测的目的单链核酸通过碱基配对相互结合的过程。假设为双链核酸则事先需要变性， 使之翻开成单链。 杂交是直接将目的序列和探针在溶液中进展杂交和检测由于不需从溶液中分别出杂交体， 因而使检测周期大为缩短，是目前最简洁的杂交程序。固相杂交固相杂交是将欲检测的核酸样品先结合到某种固相支持

8、物上交技术有以下几种。印记杂交此法包括了DNA 转移杂交法(Southern印迹法)和RNA转移杂交(Northern印迹法)。DNA 转移杂交法(Southern印迹法)先分别DNADNA按分子DNA31P标记的DNA 探针进展DNA桉酸片段分子量的大小。RNA转移杂交(Northern印迹法)是分析RNA(主要是mRNA)的分子杂交技术。其原理是与DNA转移杂交相像，不同的是RNA 转移杂交是在变性剂存在下进展凝胶电泳分别RNA或mRNA，变性剂是防止RNA 分子二级构造发生卡环的形成，保持其单链线型状态。电泳分别后，将凝胶上RNA带转移至硝酸纤维素膜上，再以探针与之杂交。膜杂交法通过狭缝

9、印迹(Slotblot)、Soutbernblot、Northemblot或转种点膜法固定到膜上的DNADNA和合成聚合物将膜上非 特异DNA依据探针要求，承受不同漂洗条件可先洗去未杂交探针。细胞内原位杂交法(原位分子杂交法)用同位素或非同位素标记的探针对感染细胞或包埋组织中的病毒核酸变性后进展杂交， 然后用放射自显影或酶催化显色法或免疫荧光法进展检测 。使用同位素标记核酸探针作细胞系统，可直接在显微镜下观看结果，它不仅可用于细胞学和组织学争辩， 还可用于其他方面。斑点分子杂交法将已经加热或碱处理变性的待测DNA 直接滴于硝酸纤维素滤膜上，(或将其直接点在滤膜上再加热或碱处理变性)用 32P或

10、125I标记的DNA者，经放射自显影可直接观看。此法简便、快速，已广泛应用于检测各种病毒核酸。夹心杂交可有效地排解杂质干扰，提高探针检测的特异性。液相杂交液相杂交是指待检测的核苷酸样品和核酸探针同时溶于杂交液中进展反响交的双链和未参与反响的单链核酸包括未结合的探针。用仪器检测并通过计算分析杂交结果。液相杂交速度快，但它的缺点是不易分别游离和杂交的探针，给常规应用带来困难。三、核酸探针技术在实际中的应用状况 在检测抗生素的耐药性、流行病学调查、恶性肿瘤、遗传病、法医学鉴定、食品卫生及兽医等方面也已应用。在病原微生物的检测方面 DNA 重视。目前，EB病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒、乙型肝

11、炎病毒、人类免疫缺陷病毒等50 毒、疱疹病毒、牛羊蓝舌病病毒、绵羊的梅迪维斯纳病毒、猪伪狂犬病毒、禽败血支原体和滑膜支原体等动物病原微生物的核酸探针也开头用于临床。在遗传性疾病及点突变的直接分析方面DNA分子中某个碱基的替换或核苷酸的插入缺失及重排都可能引起遗传性疾病。一般可以依据遗传疾病可用DNA杂交技术进展分析。对于那些基因点突变引起的限制性内切酶作用部位增加或DNADNA长度发生转变而引起的遗传疾病可用DNADNA酸链和给定的等位基因之间的一个碱基对的错配来鉴别基因型(这个等位基因在此条件下完全不能杂交)。这种方法已用于分析一抗胰蛋白酶缺陷、镰状细胞贫血。此外人的性别鉴定和法医学上人的DNA指纹分析，也广泛应用核酸探针诊断技术。在其他方面的应用检测抗生素耐药性核酸探针可直接从标本中测出细菌的耐药基因 Perine等用DNA探针查出尿路渗出液中的大多数淋球菌含有TEM 型一内酰胺酶而对青霉素G耐药。流行病学调查探针可用于争辩医源性感染中爆发流行时大量的流行菌株间的同源性解释。恶性肿瘤癌基因，