香蕉TLP基因家族的鉴定及表达

1、应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol Doi: 10.19675/ki.1006-687x.2021.01054收稿日期 Received: 2021-01-20 接受日期 Accepted: 2021-03-17国家重点研发计划课题（2019YFD1000901）、国家自然科学基金项目（31701900；31601713）、福建农林大学“校杰出青年科研人才”计划项目（xjq201721）、福建省高原学科建设经费（102/71201801101）和国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-31-15）资助 Supported by the Nation

2、al Key R&D Program of China (2019YFD1000901), the Natural Science Foundation of China (31701900；31601713), the “outstanding young scientists” project of Fujian Agriculture and Forestry University (xjq201721), the Construction of Plateau Discipline of Fujian Province (102/71201801101), and the Nation

3、al Special Fund Project for the Construction of Modern Agricultural Technology System (CARS-31-15)*通讯作者 Corresponding author (E-mail: ; )香蕉TLP基因家族的鉴定及表达刘 范1 王 斌1 武 欢1 田 娜1 伍俊为1 刘嘉鹏1 黄玉吉1* 程春振1, 2*1福建农林大学园艺学院 福州 3500022山西农业大学园艺学院 太谷 030801摘 要 类甜蛋白（Thaumatin-like proteins，TLPs）是重要的病程相关蛋白，在植物抵御生物和非生物逆境

4、中扮演者重要角色。为揭示香蕉类甜蛋白基因家族序列及表达特性，利用生物信息学方法对香蕉TLPs（MaTLPs）进行了全基因组鉴定，分析了MaTLPs的理化性质、亚细胞定位、系统进化和染色体定位情况以及该基因家族的基因结构和基因复制事件，并基于转录组数据研究了它们在低温、高温和香蕉枯萎病菌（FocTR4）胁迫下的表达情况。结果显示：香蕉共包含40个MaTLP成员，编码长度在106-333 aa之间、分子量介于11 779.98-34 292.20、等电点为4.28-9.10的蛋白质，大部分MaTLPs定位于胞外。系统进化分析显示MaTLPs可分为Group1-9，MaTLPs在进化中发生了13次片

5、段重复和2次串联重复事件。MEME分析结果显示，MaTLP家族成员含有10个motif，且大多数成员具有相同的motif数量和分布方式。MaTLPs启动子上含有大量逆境胁迫和植物激素相关顺式作用元件，同时还存在11种转录因子家族的结合位点。MaTLPs在低温、高温和 FocTR4胁迫下呈现不同程度的响应，其中MaTLP2-2和MaTLP7-1受三种逆境处理影响显著；高温和低温处理显著抑制MaTLP5-6和MaTLP11-1的表达，显著促进MaTLP9-3的表达；MaTLP4-1的表达受低温和 FocTR4影响显著，而MaTLP5-3和MaTLP6-1仅受高温显著影响。本研究表明全基因组、串联和

6、片段重复事件三者共同作用促进MaTLP基因家族成员数量的扩展，该家族部分成员在抵抗非生物胁迫和病原菌过程中发挥作用。（图7 表3 参42）关键词 香蕉；类甜蛋白；基因家族；进化分析；基因表达Identification and expression analysis of banana (Musa acuminata) TLP gene familyLIU Fan1, WANG Bin1, WU Huan1, TIAN Na1, WU Junwei1, LIU Jiapeng1, HUANG Yuji1* & CHENG Chunzhen1, 2*1 College of Horticultu

7、re, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China2 College of Horticulture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, ChinaAbstract Thaumatin-like proteins (TLPs), one kind of pathogenesis-related proteins, play very important roles in the plant responses to both biotic and ab

8、iotic stresses. To reveal the sequence characteristic and expression pattern of TLP gene family in banana. Series of bioinformatics methods were used to show physicochemical characteristics, subcellular localization, phylogenetic relationship of banana TLPs (MaTLPs), and to reveal the chromosome loc

9、ation, gene structure and gene replication events of MaTLP members. Moreover, their expression patterns under low temperature, high temperature and Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4 (FocTR4) treatments were analyzed by using transcriptome data. Totally, 40 MaTLP genes were identified

10、 from the banana genome. The sequence length of their encoded proteins was between 106 and 333 aa, their molecular weight ranges from 11 779.98 to 34 292.20, and their theoretical isoelectric points were between 4.28 and 9.10. Most of the MaTLP members were located in the extracellular. Phylogenetic

11、 relationship analysis showed that MaTLPs can be divided into 9 groups. Gene duplication analysis identified 13 segmental duplications and 2 tandem duplication events in MaTLPs during banana evolution. MEME analysis showed that MaTLPs contain 10 motifs, and most MaTLPs own the same motif number and

12、similar distribution. Promoter sequence analysis revealed that MaTLP promoters contained a large number of cis-acting elements related to light, hormone and stress response, as well as binding sites for 11 types of transcription factors. Gene expression analysis showed that MaTLPs showed different d

13、egrees of responses to low temperature, high temperature and FocTR4 treatments, among which MaTLP2-2 and MaTLP7-1 responded significantly to all the three treatments. High and low temperature treatments significantly inhibited the expression of MaTLP5-6 and MaTLP11-1, but significantly induced the e

14、xpression of MaTLP9-3. MaTLP4-1 was responsive to low temperature and FocTR4 responses, while MaTLP5-3 and MaTLP6-1 were only significantly responsive to high temperature. Results showed that whole-genome, tandem, and segmental duplication events together contribute to the expansion of MaTLPs, and s

15、ome MaTLP members were found to be responsive to abiotic stress and FocTR4 pathogen treatments.Keywords Musa acuminata; thaumatin-like protein; gene family; phylogenetic analysis; gene expression病程相关蛋白（Pathogenesis-related proteins，PRs）是一类广泛存在于植物体内的抗病防御蛋白，参与响应生物和非生物胁迫，在植物抵御病原体入侵以及适应不良环境等过程中发挥重要作用1。根

16、据序列相似性和生理生化功能特性，PR蛋白可分为17个家族（PR1-PR17），其中PR5蛋白含有类渗调蛋白和类PR5蛋白激酶受体的共有Thaumatin结构域，因此被称为类甜蛋白（Thaumatin-like proteins，TLP）2-3。绝大多数的TLP蛋白包含一段高度保守的结构域：GX-GF-xCxT-GA-DCx（1,2）-GQ-x（2,3）-C，典型的TLP蛋白上还存在REDDD五个保守氨基酸，这些序列结构能与抗真菌剂的特异性受体相结合，从而在抵抗病原菌过程中发挥功能4。TLP根据其分子质量可分为大型和小型TLP两种。大型TLP通常具有16个保守的半胱氨酸残基（Cys），能形成8个

17、二硫键，而小型TLP仅包含10个保守半胱氨酸（Cys），形成5个二硫键，这些二硫键结构有助于TLP蛋白结构的稳定以及提高蛋白质的抗高温和抗酶解能力5-6。此外，某些TLP蛋白的N端含有信号肽，引导成熟蛋白至分泌途径7。TLP蛋白具有广谱的抗真菌活性，能通过促进-1,3-葡聚糖酶和抑制真菌酶活性，使真菌细胞膜透化，以此来破坏病原菌细胞壁并达到抵抗作用8。过表达罗勒ObTLP1的拟南芥对核盘菌和灰霉菌耐受性增强，并且具有更高的干旱和盐胁迫抗性9。Zhang等10发现利用病毒诱导的基因沉默技术抑制小麦中TaLr19TLP1的表达，会导致小麦对叶锈菌的抗性显著降低。过表达水稻Ostlp的木薯炭疽病抗性

18、提高，炭疽病症状显现推迟11。过表达花生AdTLP的烟草对靶斑病菌、盐和氧化胁迫的抗性增强，并且PR1a、PI-I和PI-II基因的表达上调12。He等13发现过表达野生葡萄VaTLP的葡萄中霜霉病菌孢子繁殖以及菌丝生长速率显著降低。此外，TLP在植物应响应非生物胁迫以及激素处理过程中也发挥重要作用。例如：小麦TaPR5的表达受水杨酸、脱落酸、伤害、低温和盐胁迫的显著诱导14；黑麦叶片中TLP蛋白累积，能抑制叶片细胞结冰而起到抗冻蛋白的作用，以此增强植株的抗寒性15。香蕉（Musa spp.）是芭蕉科芭蕉属多年生草本植物，是我国热带和亚热带地区栽培的主要果树之一16-17。香蕉喜热畏寒且栽培种

19、抗逆性较弱，其生长易受到极端气候和枯萎病等外界环境压力的影响16。目前科学家们就香蕉PR基因展开了大量开展，但香蕉TLP基因的研究仅限于对单个TLP基因的克隆、表达分析、抗性和建模结构分析18-22，尚无系统研究香蕉TLP基因家族的报道。本研究利用生物信息学方法对香蕉TLP家族进行全基因组鉴定，分析了MaTLPs的理化性质、亚细胞定位、系统进化和染色体定位情况以及该基因家族的基因结构和基因复制事件，并基于转录组数据研究了它们在低温、高温和香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4，FocTR4）胁迫下的表达情况，预期本研究可

20、为揭示香蕉TLP基因家族的功能和该家族成员在香蕉抗病育种研究中的应用奠定基础。1 材料与方法1.1 香蕉TLP基因家族成员鉴定从Pfam数据库（/）获取Thaumatin（PF00314）结构域的隐马尔可夫模型文件，使用Hmmer 3.0软件中HmmSearch程序对香蕉A基因组（Musa acuminata var. DH-Pahang）数据库23（http:/banana-genome-hub.southgreen.fr/）进行搜索（E-value1e-10），去冗余后初步获得候选蛋白。使用CDD（/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在线网站对候选序列进行保守结构域鉴

21、定和筛选，并人工检查基因序列的完整性，确保每个成员都含有完整的Thaumatin结构域和基因序列。1.2 生物信息学分析采用在线网站ExPASy（/protparam/）分析香蕉TLP成员的蛋白分子量、等电点、不稳定指数和亲水性。利用TMHMM Server 2.0（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、SignalP 4.0 Server（http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和Softberry ProtComp 9.0（/berry.phtml）在线网站进行MaTLP蛋白的跨膜结构、信号肽和亚细胞定位的分析与预

22、测。运用GSDS在线软件（/）绘制基因外显子-内含子结构图。利用MEME（/meme/tools/meme）在线工具分析MaTLP蛋白保守基序，预测motif数量设为10，其他为默认参数。采用MEGAX软件中的MUSCLE程序进行香蕉、水稻24和拟南芥25TLP蛋白的多重序列比对，使用邻接法（Neighbor-joining）构建系统进化树，运行参数如下：泊松模型（Poisson model）、成对删除（Pairwise deletion）和1000次重复，利用Evolview（/evolview/）软件进行系统进化树美化。1.3 MaTLP家族成员共线性分析从香蕉基因组GFF注释文件中获取M

23、aTLP的染色体位置信息，使用MCScanX软件分析MaTLP家族成员的种内共线性关系，并用Circos软件进行结果可视化展示26-27。运用KaKs_Calclator 2.0软件计算MaTLP重复基因对的异义替换（Ka）和同义替换（Ks）值。基因复制发生时间（T）计算公式为：T=Ks/2，其中芭蕉属的进化速率（）为4.510-928。1.4 MaTLPs启动子序列分析利用TBtools软件29从香蕉基因组中提取MaTLPs的启动子序列（起始密码子ATG上游1500bp），运用在线网站PlantCARE（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/p

24、lantcare/html/）和PlantTFDB（/）进行预测分析启动子的顺式作用元件和转录因子结合位点（transcription factor binding site，TFBS）。1.5 MaTLPs基因表达分析前期研究中，我们以天宝蕉（Musa acuminata，AAA group）为材料，测定了低温和高温处理前后的香蕉叶片以及枯萎病处理前后香蕉根系的转录组。处理方法如下：低温处理：将四叶一心的天宝蕉在4 光照培养箱中处理1 d后取叶；高温处理：将五叶一心的天宝蕉在45 光照培养箱中处理3 d后取叶；香蕉枯萎病菌（FocTR4）处理：采用灌根法对四叶一心的天宝蕉进行FocTR4接种

25、，于2个月后取根30。上述处理中对照组材料为长势均匀一致、28 培养条件下的健康香蕉。从转录组数据中获取MaTLPs的表达丰度（FPKM）值，通过log2（FPKM+1）公式计算表达量，使用TBtools软件中HeatMap程序绘制基因表达量热图。2 结果与分析2.1 香蕉TLP家族成员鉴定利用TLP结构域（PF00314）对从香蕉基因组进行搜索筛选，最终鉴定出40个TLP家族成员，依据其染色体位置信息依次命名为MaTLP0-1-MaTLP11-2（表1）。MaTLPs编码长度在106-333之间、分子量介于11 779.98（MaTLP8-4）-34 292.20（MaTLP5-6）和等电点

26、为4.28-9.10的蛋白质。MaTLPs的不稳定系数介于23.31-59.95，其中29个成员为不稳定蛋白，占比72.50%；亲水性指数在0.469-0.229之间，其中16个成员为亲水蛋白，占比40.00%。信号肽预测显示除MaTLP4-3、4-4、8-1、8-2、8-3和8-4外，其他成员均含信号肽。MaTLPs中有9个成员具有1个跨膜结构域，5个成员具有2个跨膜结构域，其他成员（26个）均为非跨膜蛋白。亚细胞定位显示，绝大多数MaTLP成员定位在细胞外（87.50%），少数成员（MaTLP4-5、6-2、6-3、7-1和9-3）定位于液泡。表1 香蕉TLP家族基本信息Table 1 T

27、he information of TLP gene family in banana基因名称基因ID染色体位置氨基酸数量分子量等电点不稳定系数亲水性信号肽跨膜结构亚细胞定位Gene nameGene IDChromosome locationAmino acidsMolecular weightpIInstability indexGRAVYSignal peptideTransmembranedomainSubcellularlocalizationMaTLP0-1Ma00_g01240chrUn_random:5295624.5297619(+)31732144.844.2843.650

28、.096YES0胞外 ExtracellularMaTLP1-1Ma01_g02920chr01:1904124.1906155(-)29229520.225.1342.030.154YES0胞外 ExtracellularMaTLP1-2Ma01_g09340chr01:6753751.6755618(-)32632946.485.8059.950.229YES2胞外 ExtracellularMaTLP1-3Ma01_g11820chr01:8578703.8579984(-)31232494.514.9148.930.054YES2胞外 ExtracellularMaTLP2-1Ma02

29、_g10600chr02:20120301.20121390(-)25926081.154.7943.750.197YES0胞外 ExtracellularMaTLP2-2Ma02_g13180chr02:21693007.21694723(+)30331063.784.3545.860.192YES1胞外 ExtracellularMaTLP2-3Ma02_g17990chr02:24688742.24689791(-)25427061.858.3150.35-0.011YES0胞外 ExtracellularMaTLP3-1Ma03_g07220chr03:4981434.4982882(

30、-)24725833.408.8844.80-0.031YES1胞外 ExtracellularMaTLP3-2Ma03_g12410chr03:9565885.9568088(+)30932093.904.6952.05-0.005YES0胞外 ExtracellularMaTLP4-1Ma04_g22380chr04:24732610.24734747(+)30731440.094.4545.730.102YES1胞外 ExtracellularMaTLP4-2Ma04_g22390chr04:24738233.24739984(+)32233111.304.4951.030.184YES

31、0胞外 ExtracellularMaTLP4-3Ma04_g31660chr04:31920555.31921139(+)19421223.855.2448.82-0.282NO0胞外 ExtracellularMaTLP4-4Ma04_g31670chr04:31922463.31923050(+)19521063.744.8944.01-0.210NO0胞外 ExtracellularMaTLP4-5Ma04_g38470chr04:35993381.35994083(+)22323363.894.3132.64-0.137YES0液泡 Vacuole MaTLP5-1Ma05_g110

32、10chr05:7994153.7995806(-)32633966.004.9158.010.012YES1胞外 ExtracellularMaTLP5-2Ma05_g11020chr05:7999259.8001289(-)31832634.454.7844.720.052YES1胞外 ExtracellularMaTLP5-3Ma05_g11170chr05:8095352.8097394(+)32734102.014.9855.10-0.016YES0胞外 ExtracellularMaTLP5-4Ma05_g15520chr05:11659784.11660585(+)2432537

33、7.374.6554.050.005YES1胞外 ExtracellularMaTLP5-5Ma05_g16670chr05:17879177.17880796(-)26026942.244.7138.930.129YES2胞外 ExtracellularMaTLP5-6Ma05_g17570chr05:20580022.20582131(+)33334292.204.8052.640.060YES2胞外 ExtracellularMaTLP5-7Ma05_g21250chr05:32922014.32923603(+)31932368.135.1637.450.113YES0胞外 Extra

34、cellularMaTLP6-1Ma06_g16730chr06:11348055.11349115(+)24726473.368.0443.030.021YES1胞外 ExtracellularMaTLP6-2Ma06_g33150chr06:33896893.33897825(+)22624164.027.3428.72-0.094YES1液泡 Vacuole MaTLP6-3Ma06_g33170chr06:33902865.33903637(+)22123430.297.8429.77-0.198YES0液泡 VacuoleMaTLP7-1Ma07_g17800chr07:219692

35、99.21970259(-)22123378.094.2923.31-0.085YES0液泡 VacuoleMaTLP7-2Ma07_g19010chr07:27016096.27018410(+)30131244.024.7650.510.074YES2胞外 ExtracellularMaTLP8-1Ma08_g12700chr08:9692170.9692868(+)23224068.684.4644.63-0.108NO0胞外 ExtracellularMaTLP8-2Ma08_g12720chr08:9715075.9715878(+)26728308.536.3558.83-0.24

36、5NO0胞外 ExtracellularMaTLP8-3Ma08_g12730chr08:9716167.9716696(-)14615390.406.7937.890.128YES0胞外 ExtracellularMaTLP8-4Ma08_g12750chr08:9769287.9769607(+)10611779.984.3957.60-0.469NO0胞外 ExtracellularMaTLP8-5Ma08_g23820chr08:37180963.37182143(+)25026554.339.1044.31-0.091YES0胞外 ExtracellularMaTLP8-6Ma08_

37、g27270chr08:39578346.39579356(-)26126797.175.8440.320.122YES0胞外 ExtracellularMaTLP8-7Ma08_g33080chr08:43552510.43553954(-)27729446.417.2937.950.039YES0胞外 ExtracellularMaTLP9-1Ma09_g14910chr09:10236144.10237290(-)25126371.108.7947.550.025YES1胞外 ExtracellularMaTLP9-2Ma09_g22120chr09:34115587.34116699(

38、+)25527619.646.3951.83-0.015YES0胞外 ExtracellularMaTLP9-3Ma09_g26730chr09:37939112.37939890(+)24125668.894.6524.50-0.004YES0液泡 VacuoleMaTLP9-4Ma09_g30080chr09:40390178.40392445(-)28830752.967.3333.620.068YES0胞外 ExtracellularMaTLP10-1Ma10_g02820chr10:9675637.9677074(+)28930645.525.0339.360.008YES0胞外 E

39、xtracellularMaTLP11-1Ma11_g00980chr11:732701.734588(+)31331550.054.3044.720.100YES0胞外 ExtracellularMaTLP11-2Ma11_g22390chr11:26177621.26178464(+)24525922.876.8947.620.144YES0胞外 Extracellular2.2 香蕉TLP家族系统进化分析将本研究中鉴定的40个香蕉，以及前人报道的28个拟南芥和37个水稻TLP蛋白序列进行系统进化树构建。根据聚类关系，TLP蛋白可分为9个Group（Group1-9）（图1），其中Grou

40、p1-3自举值较高，形成单独分支，其余6组自举值相对较低且具有一定差异性。MaGLP家族成员不均匀的分布在每个分组，其中Group9的成员数量最多，包含9个成员，占比达22.50%；其次是Group7，包含7个成员；Group4、5和6数量最少，仅包含2个成员。图1 香蕉、拟南芥和水稻TLP家族系统进化树.Fig. 1 Phylogenetic tree for TLP gene families from banana, Arabidopsis and rice. 2.3 香蕉TLP家族基因结构分析香蕉TLPs基因长度介于321（MaTLP8-4）-2 315（MaTLP9-4）bp，平均外

41、显子数量为2.10个。使用GSDS对香蕉TLP家族基因外显子-内含子结构可视化，发现MaGLP成员外显子数量存在一定差异，14个成员仅含有1个外显子，占比35.00%；8个成员含有两个外显子，18个成员含有3个外显子，占比达45.00%（图2）。同一分支基因的外显子数量和分布差异较小，亲缘关系近的成员的基因结构越相似。图2 MaTLP家族基因结构.Fig. 2 Gene structures of MaTLP genes.2.4 MaTLP蛋白保守基序分析为进一步揭示MaTLP的结构和功能特性，采用在线网站MEME对香蕉TLP蛋白保守基序进行分析，共鉴定到10个保守基序，分别命名为motif1

42、-motif10（图3，表2）。大多数成员具有完整的10个保守基序，并且motif分布方式一致，均为motif4_10_3_8_6_2_7_5_1_9。6个成员仅缺失一个motif：MaTLP5-3和MaTLP5-6缺失motif7，MaTLP2-3和MaTLP8-2缺失motif9，MaTLP8-7和MaTLP9-4缺失motif10。MaTLP4-5、6-2、6-3、7-1和9-3缺失motif5和motif10；MaTLP4-4缺失motif4、9和10。MaTLP4-3和MaTLP8-3都包含6个motif，MaTLP8-4含有的motif数量最少，仅为4个。图3 MaTLP蛋白保守基

43、序示意图.Fig. 3 Schematic representation of conserved motifs of MaTLPs.表2 MaTLPs的10个保守基序Table 2 The ten conserved motif sequences of MaTLPs序号E值长度保守序列Motif No.E-valueLength/aaConservative sequencesmotif13.4e-85839GAYGNPNTCKPTSYSQFFKNACPRAYSYAYDDATSTFTCmotif22.4e-49221QDFYDVSLVDGYNLPMLVAPQmotif33.1e-38821

44、SLDAPAGWSGRFWARTGCSFDmotif48.6e-41631LLLFSGSHAATFTFVNNCPYTVWPGVLSNAGmotif52.8e-35321GEVVACKSACEAFGTPZYCCSmotif61.2e-25515GAGGAPPATLAEFTLmotif71.8e-30521GCGSTGCVADJNGLCPAELRVmotif81.9e-18111GRGSCATGDCGmotif91.3e-15711GGABYLITFCPmotif101.5e-9015ALSTTGFELPPGESR2.5 香蕉TLP家族共线性分析为了解MaTLP基因在染色体上的位置分布特征，利用C

45、ircos软件对基因注释信息进行可视化展示。如图4显示：40个MaTLP家族基因无规则的分布在11条染色体上，其中5号和8号染色体，成员数量最多，均存在7个成员；4号、9号染色体上分别存在5个和4个成员；1、2和6号染色体上各存在3个成员；11号和3号染色体上各含有2个成员；Un_random和10号染色体上仅存在1个基因。各成员在染色体上的位置存在一定差异，个别成员位于染色体的起始端和末端，如：MaTLP11位于11号染色体的起始端，而MaTLP9-4位于9号染色体的末端位置。采用MCScanX对MaTLPs进行共线性关系分析（图4），发现该家族存在15对重复基因，其中在4号和8号染色体上各

46、含有1对串联重复基因，分别为MaTLP4-3/MaTLP4-4和MaTLP8-2/MaTLP8-3。13个基因对（MaTLP1-3/MaTLP3-2、MaTLP2-1/MaTLP8-6、MaTLP2-2/MaTLP4-1、MaTLP2-2/MaTLP5-2、MaTLP3-1/MaTLP8-5、MaTLP3-1/MaTLP9-1、MaTLP4-1/MaTLP5-2、MaTLP4-1/MaTLP11-1、MaTLP4-5/MaTLP6-2、MaTLP5-4/MaTLP8-1、MaTLP5-7/MaTLP11-1、MaTLP6-2/MaTLP9-3和MaTLP8-5/MaTLP9-1）为染色体片段重

47、复基因。除Un_random、7和10号染色体外，其余染色体上均存在重复基因。MaTLP2-2、5-2和11-1具有相同的重复基因（MaTLP4-1）。此外，还发现MaTLP3-1、8-5和9-1三者互为重复基因对。为进一步了解MaTLP家族基因在进化过程是否受到自然选择压力作用并及追溯其复制时间，对香蕉重复基因对的Ka和Ks值进行计算。如表3所示，家族内所有重复基因对的Ka/Ks值均小于1，表明MaTLPs在基因复制事件发生后受到纯化选择的压力。根据Ks值估算香蕉TLP重复基因复制事件发生时间，结果显示，MaTLP5-4/MaTLP8-1的复制事件发生时间最远，大约在126.39 Mya（百

48、万年前），MaTLP8-2/MaTLP8-3的复制时间最近，大约为23.23 Mya，其它基因对复制发生时间为26.57-60.25 Mya。图4 MaTLP家族基因共线性分析。红色线表示MaTLPs的共线性关系，标绿的基因表示MaTLPs的串联复制基因Fig. 4 Collinearity analysis of MaTLP family genes. The red line indicates the collinearity of the MaTLPs, the green-bearing gene indicates the tandem replication of MaTLPs表

49、3 MaTLP家族基因复制事件Table 3 MaTLP family gene replication events基因名称基因ID基因名称基因ID复制时间（百万年）复制类型Gene NameGene IDGene NameGene IDKaKsKa/KsDuplication Date (Mya)DuplicationTypeMaTLP1-3Ma01_g11820MaTLP3-2Ma03_g124100.120.370.3240.64片段重复MaTLP2-1Ma02_g10600MaTLP8-6Ma08_g272700.110.520.2058.28片段重复MaTLP2-2Ma02_g13

50、180MaTLP4-1Ma04_g223800.100.520.1957.85片段重复MaTLP2-2Ma02_g13180MaTLP5-2Ma05_g110200.090.490.1953.93片段重复MaTLP3-1Ma03_g07220MaTLP8-5Ma08_g238200.080.440.1749.04片段重复MaTLP3-1Ma03_g07220MaTLP9-1Ma09_g149100.070.350.2038.36片段重复MaTLP4-1Ma04_g22380MaTLP5-2Ma05_g110200.070.400.1843.92片段重复MaTLP4-1Ma04_g22380Ma

51、TLP11-1Ma11_g009800.200.540.3760.03片段重复MaTLP4-5Ma04_g38470MaTLP6-2Ma06_g331500.140.530.2658.79片段重复MaTLP5-4Ma05_g15520MaTLP8-1Ma08_g127000.261.140.23126.39片段重复MaTLP5-7Ma05_g21250MaTLP11-1Ma11_g009800.170.450.3850.29片段重复MaTLP6-2Ma06_g33150MaTLP9-3Ma09_g267300.140.540.2660.25片段重复MaTLP8-5Ma08_g23820MaTL

52、P9-1Ma09_g149100.090.420.2146.19片段重复MaTLP4-3Ma04_g31660MaTLP4-4Ma04_g31670026.57串联重复MaTLP8-2Ma08_g12720MaTLP8-3Ma08_g12730023.23串联重复2.6 香蕉TLP启动子分析2.6.1 启动子顺式作用元件为了深入探究在MaTLP家族成员中可能存在的表达调控模式，本研究对40个家族成员的启动子序列进行顺式作用元件预测分析。结果显示：MaTLP家族启动子区存在大量的核心元件（TATA-box和CAAT-box），还含有光信号、激素、逆境胁

53、迫和生长发育相关作用的响应元件（图5），推测MaTLP的表达调控模式较为复杂，可能受多重因子的影响。MaTLP家族中每个成员的启动子区都含有光响应元件，其中MaTLP5-2含有数量最多（19个）。启动子区中还包含6种植物激素相关的作用元件，其中与茉莉酸甲酯相关的作用元件数量最多（152个），其次是脱落酸（92个）。MaTLP家族分别有29、28、22、19、16和15个成员含有响应茉莉酸甲酯、脱落酸、赤霉素、生长素、水杨酸和乙烯的顺式作用元件。此外，还发现每个家族成员至少含有1种植物激素相关元件，MaTLP5-5更是同时含有上述6种激素应答元件。该家族基因启动子序列中含有5类逆境胁迫响应元件，

54、包括厌氧诱导（ARE）、干旱诱导相关MYB结合位点（MBS）、低温（LTR）、防御和胁迫（TC-rich repeats）和伤害（WUN-motif）响应元件，分别存在于29、20、11、9和9个成员的启动子上，其中MaTLP8-7和MaTLP9-1不含上述逆境胁迫相关的顺式作用元件。此外，启动子上还包含一些MYBHv1结合位点、昼夜节律、分生组织表达和玉米蛋白代谢相关的特异性作用元件。图5 MaTLP家族启动子顺式作用元件分析.Fig. 5 Distribution of cis-acting elements in the promoter sequences of MaTLP gene

55、family.2.6.2 转录因子结合位点（TFBS）预测分析使用PlantTFDB在线工具分析MaTLP家族启动子区，总共预测出AP2/ERF、BBR-BPC、bZIP、C2H2、Dof、G2-like、GATA、MIKC_MADS、MYB、NAC和TALE等11种转录因子（TF）家族的结合位点（图6）。这些TFBS分别存在于18、5、3、10、11、3、5、14、5、5和4个MaTLP成员的启动子区域。AP2/ERF结合位点数量最多，达到76个，其次是MIKC_MADS和BBR-BPC，分别有75个和63个，bZIP、G2-like、GATA和MYB的数量最少，仅有5个。MaTLP启动子上

56、识别的转录因子种类、数量和分布存在较大差异，如MaTLP4-4启动子含有6种TF家族结合位点，而MaTLP1-2、4-1、5-5、6-3、7-1、8-4、9-1和9-3启动子不存在上述任何一种TFBS；MaTLP1-1的TFBS数量最多（68个），MaTLP1-3、2-1、2-2、3-2、4-5、5-7和8-5启动子上仅有1个TFBS。MaTLP1-1和MaTLP8-6的BBR-BPC结合位点数量较多，而MaTLP4-4和MaTLP5-4仅含有1个BBR-BPC位点。图6 MaTLP启动子的转录因子结合位点预测.Fig. 6 Prediction of transcription factor

57、 binding sites in the MaTLP promoters.2.7 MaTLP基因表达分析为研究MaTLP的表达模式，本研究从低温、高温和FocTR4处理的香蕉转录组中获取MaTLP的基因表达数据。从图7中可以看出，MaTLP2-2在叶片和根系中表达量较高，MaTLP5-3和MaTLP5-6在叶中优势表达，MaTLP4-1、5-2、1-2、9-3和2-3在根系中的表达量高于叶中的表达量。在4 低温处理转录组数据中发现：MaTLP7-1在4 处理叶片中表达量最高，为对照组的2.16倍（图7A）。MaTLP1-2、4-1、5-1、5-2、7-1、8-5、8-7和9-3的表达量受低温

58、影响显著，其中MaTLP1-2、4-1、7-1、8-5和9-3显著升高，分别为对照的2.92、5.89、2.16、2.48和2.71倍。5个成员的表达量下降，其中MaTLP5-6和MaTLP11-1下降最为显著，分别仅为对照组的34.17%和45.68%。MaTLP6-1在45 高温处理的叶中的表达量最高，高达对照的18.77倍（图7B）。9个（22.50%）MaTLP家族成员表达受高温诱导，其中MaTLP2-3、6-1、7-1、8-1、8-2、8-7和9-3显著诱导。11个（27.50%）家族成员的表达下调，有7个成员下调显著，其中MaTLP5-1和5-3的表达量仅为8.50%和9.43%。

59、枯萎病菌FocTR4胁迫下，9个MaTLP成员上调表达，其中MaTLP4-5、7-1、8-5和11-2显著上调，分别上调了3.34、6.22、2.69和2.24倍，而仅有2个成员（MaTLP1-3和MaTLP2-2）下调表达（图7C）。图7 MaTLP家族成员基因在低温（A）和高温（B）处理的叶片以及FocTR4处理的根系中的表达情况.Fig. 7 Diagram for the expression of all the MaTLP gene family members in low temperature (A) and high temperature (B) treated leav

60、es and FocTR4 treated banana roots (C).3 讨 论TLP家族成员在植物生长发育和应对逆境胁迫方面发挥重要功能。本研究利用生物信息学方法从香蕉A基因组中鉴定出40个香蕉TLP家族成员，成员数量多于拟南芥（28个）、水稻（37个）、大麦（19个）和葡萄（33个），但少于陆地棉（88个）和杨树（50个）24, 31-33。亚细胞定位显示，大部分MaTLP成员定位细胞外，少部分成员定位于液泡中，与张华崇等32在陆地棉上的研究结果相似，这可能与MaTLP的N端存在信号肽，能将蛋白引导至胞外或液泡中有关34。基因结构和保守基序分析发现，同分支的成员基因结构相似，并且绝