核酸浓度、纯度的检测-DNA的电泳检测

1、核酸浓度、纯度的检测DNA的电泳检测实验目 的原理：掌握紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度的原理。掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理技术技能掌握紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度的步骤和计算方 法。掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的操作1、DNA分子的琼脂糖凝胶电泳检测实验原理在中性或偏碱性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。DNA电泳速率与电荷效应无关（随着碱基数的增加，DNA 分子量增加，电荷数也增加，这样荷质比基本维持一个常 数）。琼脂糖凝胶作为一种固体支持基质,主要利用DNA分子在 电场中的泳动时的分子筛效应来达到分离混合物的目的。在恒电场的一定电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于 由D

2、NA分子的大小与构型。DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。700bp900bp电泳方向相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。）质粒DNA的分子构型 (a)松弛线性的DNA（L (b)松弛开环（OC） (c)超螺旋（cccDNA）三种构型的质粒的电泳模式图谱影响电泳速率的因素DNA分子量的大小琼脂糖凝胶的浓度DNA的分子构象电压电泳缓冲液的离子强度琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%溴酚兰的迁移率： 与之相当的DNA大小1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度1%1.4%二甲苯青迁移率：与 之相当的DNA大小2Kb1.6Kb1、琼脂糖2、TBE缓冲液: 临用时用水稀至0

3、.5TBE( pH8.08.2)3、核酸电泳的指示剂溴酚兰：在碱性液体中呈紫蓝色二甲苯青：在碱性液体中呈蓝色在电泳中，溴酚兰和二甲苯青的迁移率与下列双链线性DNA片段相当：试剂4、载样缓冲液(Loading Buffer)注：指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液， 其作用是：增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度 和位置使样品呈色，使加样操作更方便5、荧光染料(GoldView，GV)GoldView (GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核 酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在 100ml琼

4、脂糖胶溶液中加入5l GoldView即可。在紫外透射光 下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈现红色荧光。GoldView 不仅能染DNA，也可用于染RNA。PCR扩增产物的检测1.琼脂糖凝胶的制备 根据样品DNA片段大小确定琼脂糖凝胶浓度； 胶板的制备：胶槽置于水平支持物上（两侧封口）, 插上样品梳子, 注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保 持1mm左右的间隙； 胶液的制备：称取0.2g琼脂糖,置于100ml锥形瓶中,加入 20ml 0.5TBE稀释缓冲液,用保鲜膜封口（避免水蒸气 过度散失），然后在上面用枪头扎个小孔（加热过程中 可以放出少量水汽，以免瓶内压力过大）， 放入微波炉 里加热至

5、琼脂糖全部熔化（1-2min, 液体变透明）,取出 摇匀（烫手！）,此为1%琼脂糖凝胶液。待胶冷却到60 度左右，加入DNA染料Goldview 2 ul，混匀； 倒胶：将胶液缓慢倒入胶板内，注意：倒胶时的温度不 可太低,否则凝固不均匀；速度也不可太快,否则容易出现 气泡。 待胶完全凝固后（10min）,拨出梳子,注意不要损伤凝胶, 然后向槽内加入0.5TBE稀释缓冲液至液面恰好没过凝 胶的上表面。2.加样：将下列样品在洁净的保鲜膜或一次性手套表面混匀，用微量移液枪小心加入凝胶的样品孔中。8l PCR产物 + 2l6载样液8l 质粒提取物 + 2l6载样液8l pUC19 质粒 + 2l6载样

6、液(阳性对照)5 lDL2000 Ladder Marker (DNA marker) 5 lEcoR T14Marker (阳性对照)注：注意点样品要放阴极端！每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染；注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。加样顺序电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压 最高不超过5V/cm（按两极间距离计算出总电压） 。当 溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 (125V, 30min)观察和拍照在透射仪的样品台上铺一张保鲜膜（全班共用一张保 鲜膜），赶去气泡，然后将胶槽内的胶块小心滑出至 样品台上面。在300nm波长紫外透

7、射仪下观察电泳胶板。DNA存 在处显示出肉眼可辨的绿色条带。紫光灯下观察时应 戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 可拍 照记录实验结果。本实验的预期结果PCR产物电泳照片图1: DNA Marker DL2,0002、3: PCR扩增产物（500bp片段）DL2000 DNA分子量标准bpDNA分子量标准500bpDL2000PCR产物质粒在正常情况下以cccDNA构型存在，在提取过程中由于机 械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。所以， 多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状 DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线形DNA(lDNA)质粒DNA

8、琼脂糖凝胶电泳模式图2、紫外分光光度法检测核酸的浓度、纯度基本原理DNA链上碱基的嘌呤环和嘧啶环结构具有吸收紫 外光的性质，其最大吸收峰在260nm处。单链核酸（RNA）由于其碱基暴露，所以其吸光度较双链高。浓度测定：在一定范围内，DNA或RNA的光密度OD260与其含量成正比。 当使用1cm比色杯，OD2601时，dsDNA浓度约为50g /ml，RNA浓 度约为40g/ml；寡核苷酸浓度约为30g/ml。根据以下公式可 以计算DNA在溶液中的浓度：质粒DNA浓度(g / l )=稀释倍数OD26050/(1000 L）其中：L为比色杯的光程（杯的厚度）；“50”为DNA在OD260=1时的

9、 浓度。质粒DNA浓度(ng / l )=稀释倍数OD26050注：OD260值应在01之间，以在0.5左右为好。这样读数比较准确。纯度测定：当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会 影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、 OD280（280nm是蛋白质的吸收峰）和OD230（230nm是酚类等杂质的吸 收峰），计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染或DNA降解；1.6，表明有蛋白质或酚污染） 纯RNA： OD260/OD2802.0 (1.8 2.2)实验步骤取10 l自提的质粒DNA溶液

10、用ddH2O稀释10倍（终体积：100 l）。以蒸馏水作参比，对仪器进行调零等调整后，测定质粒样 品的OD260和OD280。计算OD260/OD280之比,判断其纯度。计算质粒样品的浓度：DNA浓度(ng / ul )=稀释倍数OD26050岛津UVmini-1240紫外分光光度计的使用步骤1. 打开电源，系统开始自检（6min）取3个比色皿，各加入100ulddH2O,并放入样品室（最靠近 我们的比色皿（1号）为对照）选择“1. 光度模式”4. 设置波长（260nm）: go to WL调空白： 按“空白”键，调节不同比色皿透光值误差自动调零： Auto ZERO，空白样品透光值归零取出第

11、二、三号比色皿，倒掉ddH2O，加入100ul预先混好 的质粒DNA样品，关上盖，按“Start”，开始测量OD260, 记录结果设置波长（280nm）: go to WL自动调零： Auto ZERO，空白样品透光值归零按“Start”，开始测量OD280，记录结果。实 验 报 告 （一）1、记录PCR扩增产物和质粒样品的电泳图谱，说明带型含义（对结果和出现的问题进行分析，如若未获得单一的扩增带， 这是什么原因造成的？扩增带颜色深浅说明什么等；将质粒 样品与标准的pUC19质粒比较。）2、记录质粒DNA的OD260、OD280等原始数据，计算比值和浓度， 并分析结果： OD260/OD280比值高或低各说明什么？思考题恒定电场强度下，琼脂糖凝胶电泳只适于分离多大的DNA片段？（20-50Kb）若有60kb100kb大小的系列DNA片段要进行分离鉴定，问