中性粒细胞分离实验步骤

1、本文格式为Word版，下载可任意编辑 中性粒细胞分离实验步骤 中性粒细胞分开试验步骤 一、中性粒细胞初步分选 试剂与耗材：人淋巴细胞分开液、RP160、1m离心管4支,棉球,止血带、碘伏、采血针,mlETA抗凝采血管2支。1m枪及枪头. 分开步骤: 1.所有试剂恢复至室温; 2.EDTA抗凝采血管收集人外周血10m; 3.分别将5m外周血参与m人淋巴细胞分开液中（15ml离心管中进行)； 注意动作轻柔缓缓参与; 4.00g离心,3-5分钟,室温； 5.离心后收集低带中性粒细胞，分两层,第一层为单核细胞,其次层为中性粒细 胞;(若离心后分层不明显则多离心510分钟) 6.将RP6用纯水稀释为50

2、RP64用于重悬中性粒细胞,恢复细胞活 性。(5-0分钟) 7.00g离心10分钟,去上清，收集中性粒细胞，重悬于P160中,细胞计数。 二、中性粒细胞磁珠分选 试剂耗材及设备：磁力分选器,磁柱，CD15磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液50ml，RP1，1l枪及枪头,0微升枪与枪头,5l离心管4支，细胞计数板。步骤: 1.制冰,保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在8内进行分选； 2.配液磁珠分选缓冲液（50ml PBS液中含2mml/L EDA,.5%BA，P =7。2); 3.将上步初步分选的中性粒细胞悬液300g离心10分钟，去上清; 4.细胞重悬于磁珠分选缓冲液中，0细胞重悬于80微升缓冲液中

3、；(如细胞 数多按倍数增加) 5.10细胞中参与20微升D15磁珠;充分混匀放入避光孵育5分钟; 6.用12l缓冲液洗涤细胞107细胞，300g离心10分钟,去上清； 7.重悬细胞于缓冲液中,108细胞重悬于50微升缓冲液中; 8.将磁力分选器置于冰盒中,用缓冲液冲洗磁柱; 9.将含有中性粒细胞的缓冲液参与磁柱中; 10.用缓冲液冲洗磁柱，每次ml,冲洗3次; 11.除去磁场,把磁柱放置于5离心管上，用5ml缓冲液加压快速冲洗磁柱; 12.离心管中收集的便是中性粒细胞； 13.30g离心去上清，重悬细胞于1ml细胞培养液中,细胞计数。 三、细胞活力检测 中性粒细胞分开试验步骤 步骤： 1、4%

4、台盼蓝母液：称取4台盼蓝,加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至10ml，用滤纸过滤4度保存。使用时.用PS稀释至. 2、胰酶消化贴壁细胞,制备单细胞悬液,并作适当稀释. 、染色：细胞悬液与0.4台盼蓝溶液以9：1混合混匀。(终浓度04) 4、计数:在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。 、镜下观测,死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。 6、统计细胞活力:活细胞率（)= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数)0% 四、细胞分组铺板给药 试剂耗材及设备:六孔板2个，1ml枪及枪头,0微升枪与枪头，ml离心管4支，细胞计数板. 1. 10ml外周血大约可分出1107个细胞； 分为10组： 空白组

5、单I组单A V组 I、A双染组I、A V、CD15三染组 S/l组LS+Nec1 50g/l组LPS+Nc-1 5/m组 Ne-1 50gm组c5g/ml组. 3。铺板,每孔1m细胞悬液，给药,空白组给予DMSO.（LPS浓度选择1/l,由于此浓度刺激中性粒细胞后出现凋亡率较低,坏死率较高。ec浓度作用于神经细胞为7ml50gm） 五、细胞凋亡率检测 耗材试剂：1ml枪及枪头,20微升枪与枪头,1.5m离心管15个，凋亡检测试剂盒,CD15抗体. 细胞培养一段时间后（3、6、12、2、36小时)，离心(200pm离心5min）收集细胞; 2. 用PBS 洗涤细胞二次(200rp离心5min）收集150细胞;