斑点印迹法和一些分子生态学方法

1、1、调研什么是斑点/狭缝印迹，其用途是什么。2、简单总结以下方法的用途和特点DGGE (变性梯度凝胶电泳)TGGE (温度梯度凝胶电泳)SSCP (单链构象多样性)分析T-RFLP (末端限制性酶切片段长度多态性)分析定义：斑点杂交(Dot blot)是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半 定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪(Manifold),如 Minifold I和 II、Bio-Dot(Bio-Rad)和 Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到 孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照

2、 射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。DNA斑点杂交：先将膜在水中浸湿，再放到15xSSC中。将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上，每个样品一般点5gl(210gg DNA)。将膜烘干，密封保存备用。RNA斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加10gg总RNA (经酚/氯仿或异硫氰酸胍 提取纯化)，方法是将RNA溶于5gl DEPC水，加5gl甲醛/SSC缓冲液(IQxSSC中含6.15mol/L 甲醛)，使RNA变性，然后取5-8gl点样于处理好的滤膜上，烘干。完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进

3、行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规 方法进行杂交与检测。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜 上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它 不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。用途：可对DNA、RNA进行检测和分析，在菌种亲缘关系鉴定、疾病监测、重组细 菌检测等方面广泛应用于基因工程和分子生物学工程。2、DGGE： (denaturing gradient gel electrophoresis)，即变性梯度凝胶电泳，是根据 DNA 在 不同浓度的变性剂中解链行

4、为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱 基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的 线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方 向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导 致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段 很理想地分开，它是一种很有用分子标记方法。DGGE特点：DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌古菌、微型真核生物、真核 生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样 品，具

5、有可重复和操作简单等特点，适合于调查种群的时空变化，并且可通过对条带的序列 分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成DGGE通过逐渐增加的化学变性剂线性浓度梯 度可以把长度相同但只有一个碱基不同的DNA片段分离。DGGE用途：广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。3、TGGE : (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)温度梯度凝胶电泳(TGGE )是一种用于分离和分析核酸序列变异和点突变的电泳方法。该方 法利用长度相同、序列不同的核酸分子具有不同构象(Conformation)从而具有不同的变性温 度(Tm)来进行分离。分为

6、垂直TGGE电泳和平行TGGE电泳。垂直TGGE电泳：电泳方向与温梯方向垂直，用于优化某个样本的分离条件，也可用于检 测PCR产物样本组成平行TGGE电泳平行TGGE电泳：电泳方向与温梯方向平行，可采用垂直TGGE所优化的电泳条件，用于 分析多个样本样本。当温度升高至TmA，双链DNA变成分叉双链，导致迁移率的下降。当温度升高至TmB， 双链完全解开，此时分子的电泳速度最慢；当全部形成单链后，泳动速度又将加快。 不同的核酸具有不同的熔解温度，从而引起不同的迁移速率。TGGE特点：分辨率高宽广的温度控制范围(5-80C)。2mm的电泳距离最大可对应0.6C 的温度差，100%突检测单基因突变。重

7、复性好电泳条件易控制，可保证电泳结果的重复性加样量少1-5ng DNA，DNA或RNA片段可以清晰地相互区分开。节约时间小面积温度梯度板和小尺寸凝胶大大节约电泳时间。操作简单实验条件便于优化(免费软件Poland)0TGGE用途：基因点突变研究(少条带)，广泛地应用于微生物群落多样性和动态性分析(多 条带)4、SSCPSSCP： (Single-Strand Conformation Polymorphism， SSCP)分析，一种基于 DNA 构象差别来 检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样 就形成了单链构象多态性。单链DNA片段呈复杂的空间折叠构

8、象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影 响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受 排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有 差异的分子分离开.SSCP特点：该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要旦它也有 不足之处.例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步 测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象 的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点

9、突变对单链DNA分子立体构 象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨 造成漏检。SSCP用途：检测基因点突变5、T-RFLP:(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)T-RFLP是末端限制性片段长度多态性，它是根据16S rRNA的保守区设计通用引物。其中 一个引物的5端用荧光物质标记，常用荧光物质有HEX、1ET 6. FAM等。提取待分析 样品的总DNA，以它为摸板进行PCR扩增，所得到的PCR产物一端就带有这种荧光标记。 然后，将PCR产物用合适的限制性内切酶消化，一般选用酶切位点为4b

10、p的限制性内切酶。 由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会 产生许多不同长度的限制性片段。消化产物用自动测序仪(选用genescan功能)进行检测，就 只有末端带荧光标记的片段能被检测到，而其他没有带荧光标记的片段则检测不到。这些末 端标记的片段就可以反映微生物群落组成情况，因为不同长度的末端限制性片段必然代表不 同的细菌，也就是说一种末端限制性片段至少代表一种细菌。T-RFLP 特点：（1）T -RFLP是建立在PCR基础之上一种新的微生物生态学研究方法。该方法克服了传统 微生物培养方法的限制、应用快速、灵敏度高且输出定量的数据结果，序列数据库具有直接 的参考意义，也就是说,从消化产物中获得的所有的末端片段大小，可以与越来越丰富的序 列数据库中的末端片段相对比，从而可以做系统发育的推断。A（2）核酸测序技术要比DGG