核酸检测全覆盖后仍需关注 或探讨的问题

1、核酸检测全覆盖后仍需关注 或探讨的问题关注或探讨的问题:血液筛查实验室质量管理体系的持续 改进问题？核酸检测全覆盖后的血液筛查策略问 题？核酸检测全覆盖后ELISA检测的灰区设 置问题？化学发光检测技术引入血液筛查的必 要性？实验室质量管理体系的持续改进2016年全国血液安全技术核查(一般 血站)1-是否建立血液核酸检测实验室质量 管理体系和工作制度,明确相关责任人并 将实验室质量控制和监督管理纳入日常 质量管理实验室质量管理体系的持续改进核酸检测实验室质量管理体系和工作制 度不完善;血液筛查实验室(酶免与核酸检测)质量 管理体系的有机融合(检验科)；核酸血液筛查纳入整个血液质量管理体 系:过

2、程检查、内审、外审、管理评审（ 质量管理科）实验室质量管理体系的持续改进核酸血液筛查的过程检查及内审的依据血站实验室质量管理规范血站技术操作规程（2015版）实验室质量管理体系的持续改进 4.3仪器设备使用要求4.3.1新的或者经过维修后可能影响检测结果 的检测设备在正式投入正常使用之前应经过 确认。新设备的确认应包括安装确认、运行 确认和性能确认。经过大修的设备根据需要 进行适当确认，必要时应进行计量检定或校 准。核酸检测系统正式投入使用之前，还应 进行分析灵敏度验证。实验室质量管理体系的持续改进4.5核酸检测实验室防污染控制4.5.1核酸检测实验室分区及功能要求。原 则上可以设置3个独立的

3、工作区域: 试剂耗 材储存与准备区、标本处理和标本制备区（ 核酸纯化）、扩增检测区，各区域空间完全 相互独立，不能直接相通。其中试剂耗材储 存与准备区必须独立设置；如果单机检测设 备可以实现混样、核酸纯化、扩增检测中的 两项或多项功能，相关区域可以根据设备功 能进行相应合并。实验室质量管理体系的持续改进条款解读各区的功能要求试剂耗材储存与准备区：该区必须独立设置。用于试剂的制备、分装和扩增反应混合液 的准备；离心管、吸头等耗材的贮存和准备。试剂盒中的阳性对照品及质控品不能保存 在该区，应保存在标本处理和标本制备区。标本处理和标本制备区：核酸纯化前标本的 保存、开盖和混合；核酸的提取和纯化扩增检

4、测区：cDNA合成、DNA扩增及检测。实验室质量管理体系的持续改进条款解读分区要求各区必需独立设置,不能直接相通。物理上完全分开的各自独立的区域；分区装修隔断必需密封，不能留有门缝；不能有通过连通各区的中央空调（室内机为 自循环除外）；如设置传递窗必需为双开门密封严实的有连 锁装置的传递窗；实验室质量管理体系的持续改进条款解读非单机检测设备必须分3个独立的工作区:试剂耗材储存与准备区标本处理和标本制备区扩增检测区单机检测设备可以分2个独立的工作区试剂试剂耗材储存与准备区标本处理制备、扩增检测区实验室质量管理体系的持续改进常用的核酸检测系统的分区设置按照“4.5.1条款”的分区要求基立福的Pro

5、cleix TIGRIS系统，至少设2个 区，试剂耗材储存与准备区，标本处理和标 本制备区（核酸纯化）区、扩增检测区合并。（建议也设3个区）罗氏COBAS s201系统、科华、浩源、达安、 华益美、万泰核酸检测系统，设3个区，试 剂耗材储存与准备区、标本处理和标本制备 区（核酸纯化）、扩增检测区。实验室质量管理体系的持续改进核酸检测实验室通风系统（4.5.2条款） 实验室实施空气流向控制，扩增前和扩增 后区域应具有独立通风系统，扩增后区域 保持负压状态，其它区域保持正压或常压 状态，防止扩增产物进入扩增前的区域。实验室质量管理体系的持续改进条款解读标本处理和标本制备区和扩增检测区， 要有独立通

6、风系统；试剂耗材储存与准备区和标本处理和标 本制备区最好为正压状态，也可为常压 状态；扩增检测区必须为负压状态；控制空气流向：从试剂耗材储存与准备 区标本处理和标本制备区扩增检测 区的方向流动。实验室质量管理体系的持续改进条款解读控制空气流向的目的：在物理空间完全相互独立的基础上，各区 域无论在空间上还是在使用中，始终处于 完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。防止扩增产物顺空气气流进入上游扩增前 的“洁净”区域。实验室质量管理体系的持续改进条款解读实验室空气流向的控制手段：通过缓冲间正压进风控制空气流向：在缓冲间顶上安设进风装置，经通风管道 进行送风，当进风装置运行时，缓冲间内 即为正压状态

7、，形成一个“风帘”，使实 验区域内的空气不能流向实验室外。实验室质量管理体系的持续改进条款解读通过相对正压控制空气流向实验室质量管理体系的持续改进条款解读通过缓冲间负压排风控制空气流向：在缓冲间顶上安设排风装置，经通风管道 向大气外进行排风，当排风装置运行时， 缓冲间即为负压状态，一旦有实验区外的 风进入，其在缓冲间内即被抽走，从而实 验室外的空气不会到实验区域内。实验室质量管理体系的持续改进条款解读通过相对负压控制空气流向实验室质量管理体系的持续改进条款解读通过在不同区内安装独立的通风系统， 通过控制各区的给排风强度，形成负压 差，控制空气从试剂耗材储存与准备区标本处理和标本制备区扩增检测区

8、 的方向流动，避免空气的反向流动，将 后区的扩增产物带向前区的洁净区域。可通过在房间内安装不同功率或数量的 排风扇来满足要求，简便易行。实验室质量管理体系的持续改进核酸检测实验室的清洁、消毒及环境监 控。（4.5.3条款） 核酸检测实验室应具有清洁、消毒设施，在 试验结束后对实验室地面、实验台面和空气 实施清洁和消毒。消毒时应使用各区域专用 的清洁用具，遵循从清洁区域向污染区域实 施消毒的原则，防止交叉污染。实验室质量管理体系的持续改进条款解读实验室须配备的清洁、消毒设施。各区缓冲间、工作区域内应有固定于房顶的紫 外灯，便于工作后区域内的空气照射；传递窗内应有紫外照射装置；各工作区域内应配备可

9、移动紫外灯，便于工作 后实验台面的照射；70%的乙醇，用于仪器设备的擦拭；浓的次氯酸钠溶液（5g/100ml)，次氯酸钠溶液 应用液配制器具，如塑料量筒或量杯等。实验室质量管理体系的持续改进条款解读试验结束后的实验室清洁、消毒方法各区域清洁、消毒用具专用（有区别标志）；顺序：从试剂耗材储存与准备区标本处理和 标本制备区扩增检测区；地面使用2%10%的次氯酸钠，实验台面使用 10%的次氯酸钠清洁，作用一定时间后，用清 水洗去次氯酸钠。次氯酸钠新鲜配制。实验室质量管理体系的持续改进条款解读实验室的清洁、消毒方法仪器设备用一次性纸巾或无纺布和70%的乙醇 擦拭；可移动紫外灯近距离照射可能受污染的实验

10、台 面(1小时以上)；空气消毒：紫外线照射；实验室通风。实验室质量管理体系的持续改进核酸检测实验室污染的控制(4.5.4条款)单向工作流向制度。防止实验室核酸扩增产物污染和交叉污染的 措施。实验室质量管理体系的持续改进条款解读单向工作流向制度标本处理区不能兼做标本接收，防止过多人员 进入标本处理区域造成污染；实验室人员和物品的工作流向：试剂耗材储存 与准备区标本处理和标本制备区扩增检测 区的方向，不得逆向流动；需要逆向流动的非一次性的试管架、载架等实 验器材，必需经清洁、消毒后才能返回上个工 作区。剩余试剂和耗材不能再返回试剂耗材储存与准 备区。实验室质量管理体系的持续改进条款解读防止实验室核

11、酸扩增产物污染和交叉污染的 措施。严格执行实验室分区制度；各区域只用于特定的操作，不得从事其它工 作；（注意核酸提取试剂的储存和准备）各区域的试剂、仪器、设备及各种物品包括 试验记录、标记笔等均为该区专用，不得交 叉使用。（各区可移动物品的标识）实验室质量管理体系的持续改进 4.6.3 血液标本管的选择4.6.3.1 核酸检测标本管应使用无菌、无DNA 酶、无RNA酶的真空采血管，宜采用含惰性 分离胶的乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗 凝真空采血管。采血管的保存温度应不高于 25C。标本因运输或检测频次等原因不能在 72小时内完成检测时，标本需要进行冷冻保 存，冷冻保存的采血管应经过性能验

12、证，包 括采血管材质耐低温性能、惰性分离胶耐低 温性能。实验室质量管理体系的持续改进 4.6.4 血液标本的采集与标识4.6.5.2 核酸检测标本采集后，应在4小时内 离心，分离细胞和血浆。如不能按上述要求 处理采集的标本，应对所采集标本的处理方 式进行确认，应定期进行质量监控。标本需 要冰冻运输或保存的，宜采用水平离心机， 以防止二次离心时胶面不平整发生断裂；离 心后24小时内在-40C -18C冻存。实验室质量管理体系的持续改进 4.6.8 标本接收后的处理及保存4.6.8. 1 核酸检测标本的开盖应在生物安全 柜或正压环境中，或者全自动开盖系统中进 行，自动开盖和手工开盖均应有防止标本交

13、 叉污染的措施。实验室质量管理体系的持续改进 4.6.8 标本接收后的处理及保存4.6.8. 2核酸检测标本加样（汇集）前和加 样（汇集）后转移在2-8中保存。用于血 清学检测的标本，应于采样后1周内完成检 测；用于核酸检测的标本应于采样后72小 时内完成检测，因特殊情况不能在上述时限 内完成检测的标本应在-20以下冻存。冻 存的标本应在2-8C或18-25C条件下复融。 完全复融后标本轻轻颠倒混匀3-5次，如有 纤原析出，应在标本采集时的离心条件下进 行再次离心，同时检查标本条码是否破损。实验室质量管理体系的持续改进 4.8试验性能监控反映试验系统变化的参数：核酸检测 系统初筛阳性率（混检或

14、联检阳性率）、鉴 别阳性率、拆分阳性率等。用于实时监控试验性能的试验对照和 质控品若由试剂厂商提供，其检测值应满足 试剂说明书的有效性判定标准。在此基础上，实验室应增加使用第三方提供的质控品（ 外部质控品）实时监控试验性能。实验室质量管理体系的持续改进CT罗氏A机HIV-RNA 2月质控图393837363534333231日期室内质控及CT值变化趋势实验室质量管理体系的持续改进CT罗氏C机HIV-RNA 2月质控图42.041.040.039.038.037.036.035.034.033.032.0日期室内质控及CT值变化趋势实验室质量管理体系的持续改进 4.9 试验结果的判定4.9.4

15、对基于PCR检测原理的核酸检测系统，应观察整体扩增曲线，对结果的有效性 进行判定。对非特异扩增曲线，应分析原 因，必要时对该标本重新进行检测。实验室质量管理体系的持续改进异常扩增曲线的分析实验室质量管理体系的持续改进异常扩增曲线的分析实验室质量管理体系的持续改进异常扩增曲线的分析实验室质量管理体系的持续改进异常扩增曲线的分析实验室质量管理体系的持续改进实验室质量管理体系的持续改进异常扩增曲线的分析异常扩增曲线的分析实验室质量管理体系的持续改进异常扩增曲线的分析实验室质量管理体系的持续改进异常扩增曲线的分析实验室质量管理体系的持续改进异常扩增曲线的分析阴性对照呈阳性实验室质量管理体系的持续改进实

16、验室质量管理体系的持续改进COBASs201 一代试剂样本 CT=24.7, IC部分被抑制，为HCV阳性样本实验室质量管理体系的持续改进COBASs201 一代试剂样本病毒载量浓度过高， CT=19.2, IC完全被抑制，为HIV阳性样本实验室质量管理体系的持续改进 cobas s 201二代试剂：采用多色荧光检测技术， 1管 同时检测并鉴别3种病毒。在病毒高拷贝情况下的内标被 抑制也有所改进。CH1为HIV、CH2为HBV CH3为HCV、CH4为内标血液筛查策略问题血站技术操作规程(2015版)4.1.2.2 检测策略（1）HIV、HBV和HCV:实施核酸检测试剂批签 发之前，应采用2遍

17、血清学检测和1遍核酸 检测；试剂批签发之后，应采用核酸和血 清学检测2种方法各进行1次检测。对于酶 免检测阳性的标本可不再进行核酸检测， 直接视为该项目检测结果不合格。血液筛查策略问题血站技术操作规程(2015版)4.1.2.2 检测策略（1）HIV、HBV和HCV:实施核酸检测试剂批签 发之前，应采用2遍血清学检测和1遍核酸 检测；试剂批签发之后，应采用核酸和血 清学检测2种方法各进行1次检测。对于酶 免检测阳性的标本可不再进行核酸检测， 直接视为该项目检测结果不合格。血液筛查策略问题血站技术操作规程(2015版)4.1.2.2 检测策略（1）HIV、HBV和HCV:实施核酸检测试剂批签 发

18、之前，应采用2遍血清学检测和1遍核酸 检测；试剂批签发之后，应采用核酸和血 清学检测2种方法各进行1次检测。对于酶 免检测阳性的标本可不再进行核酸检测， 直接视为该项目检测结果不合格。血液筛查策略问题样本总 数复检所用 试剂结果 为阴性复检出现1 家或以上试 剂阳性确认结果阴性不确定阳性1028204824138635511.600.321.280.220.990.08摘自王露楠课件抗HCV酶免单试剂阳性的结果(2010年核酸 检测试点单位数据641,482血液筛查策略问题126457份献血者样本检出ELISA单试剂 反应性、NAT阴性标本352例：抗-HCV：A试剂反应性79例，确证试验（R

19、IBA）阳性1例，随访3个月后仍为 阳性；B试剂反应性36例，RIBA阳性4 例，随访3个月后，4例中RIBA试验1例 转为阴性，1例转为不确定，2例仍为 阳性。血液筛查策略问题HBsAg：A试剂反应性112例，确证 试验（中和试验）阳性11例，有8例实 现成功随访，3个月后2例转为阴性，1 例转为A和C双试剂反应性，但NAT阴 性、中和试验阳性，5例仍为A试剂反应 性及中和试验阳性、但4例NAT转为阳 性；C试剂反应性37例，中和试验阳性 1例，3个月后随访仍为阳性。血液筛查策略问题抗-HIV-1/2：ELISA单试剂反应性、 NAT阴性88例，确证试验（WB）均为 阴性。HBsAg ELI

20、SA A试剂反应性、NAT阳性 5例（5/11）；未检出抗-HIV-1/2、 抗-HCV ELISA单试剂反应性伴NAT阳 性标本。血液筛查策略问题虽然血站实验室质量管理水平有了很大的提 高，但实验室的检测能力受到：不同ELISA试剂厂家检测HBsAg突变株的能力 及检测灵敏度的不同各厂家anti-HCV的ELISA检测试剂质量差别;各厂家Anti-HIV的ELISA检测试剂质量差异 较小，检测灵敏度和特异性普遍较高；再者 几乎没有Anti-HIV阳性而核酸阴性感染者;血液筛查策略问题HBV和HCV仍采用2遍ELISA检测和1遍 核酸检测;HIV采用1遍ELISA检测和1遍核酸检 测;血站技术

21、操作规程（2015版）检测方法检测方法包括：核酸扩增检测技术，包括转录介导的核酸扩 增检测技术（TMA）、实时荧光聚合酶链反应（PCR）；血清学检测技术，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫分析试验（CLIA）。化学发光免疫分析技术引入血液 筛查的必要性化学发光免疫分析技术CLEIA直接CLIAECLIA标记物Apase/HRP吖啶酯三联吡啶钌反应类型夹心法 竞争法夹心法 竞争法夹心法 竞争法发光底物鲁米诺NaOH-H2O2电激发光信号辉光闪光电激发闪光简便快速较快速快速最快速影响因素较多少少检测成本低高高化学发光检测试剂的评价国家卫生计生委临检中心评估项目样本总数为3448份,来

22、自国家卫计 委临床检验中心和14家血站ElISA筛查HBsAg反应性样本896份HCV抗体反应性样本724份HIV抗体反应性样本453份TP抗体反应性样本793份阴性样本582份样本总数HBsAgHCVHIVTPELISAELISA试剂厂家 代码230032300123021230892310723081230432300323001230212308923107230812308523043230432300123003230812308923085231072300323001230432308123016参与评估血站 数量均为3个血站23001有4个血站参与评估，其 他为3个血站2308

23、9、23085试剂有4个血站的参与评估， 其他为3个血站23043试剂有5个血站参与评估 其他为3个血站，试剂评价范围和方法厂家试剂检测结果的确定：参与血站实验室检测结果均为阳性时，结果判 定为阳性；检测结果均为阴性时，结果判定为阴性；检测结果不一致时，以多数实验室的检测结果 为准；检测结果不一致且不同结果数为1:1时，请实 验室进行双孔复检。试剂评价范围和方法各项目每个样本最终结果的确定 :国家卫计委临床检验中心使用两个厂家化学发光试剂 进行检测；各参与血站使用各厂家的ELISA试剂常规 检测，以S/CO1作为阳性判定标准，S/CO1 作为 阴性判定标准。同时报告样本检测的S/CO值。所有厂

24、 家检测结果均为阳性时即确定为真阳性，所有厂家检 测结果均为阴性时即判为真阴性，结果不一致时，采 用确认的方法。剔出结果不确定的样本,不纳入数据 统计。试剂评价范围和方法各个项目的确认方法：HBsAg:中和试验采用对应的化学发光的中和试剂进行，有任何 一家确认试剂确认为阳性的，该样本检测结果即为阳性 。抗HCV:所有检测结果不一致的样本均作单人份核酸检测和RIBA 实验，核酸阳性或RIBA阳性均判定为该样本为阳性，核酸阴性 且RIBA阴性判为该样本检测结果为阴性。核酸阴性且RIBA结果 不确定时，该样本不用于产生试剂评估的数据。抗HIV: 所有检测结果不一致的样本均作单人份核酸检测，核酸阳性即

25、最终结果为阳性，核酸阴性即最终结果为阴性。TP: 作TPPA、WB(IgG IgM)检测，任何一个方法确认阳性即为阳 性结果。各方法确认均为阴性时结果为阴性。试剂评价范围和方法ELISA血筛试剂盒灰区界点值的确定数据统计利用SSPS软件分析试剂评估数据。计算在 不同S/CO值下试剂的约登指数，约登指数=（灵敏度+特异性）-1，以S/CO值为横坐标，约登指数为纵坐标，绘制曲线。化学发光检测试剂与ELISA试剂的评价HBsAg检测试剂的灵敏度和特异性比较试剂代码灵敏度（）特异性（）约登指数2300190.5897.710.882300384.4298.510.832302191.6197.020.892304381.5197.020.782308184.5998.240.832308986.9992.570.802310791.2795.420.87罗氏发光99.6698.720.98Y家发光96.4099.310.95化学发光检测试剂与ELISA试剂的评价HCV抗体检测试剂的灵敏度和特异性比较试剂代码灵敏度（）特异性（）约登指数2300146.6882.120.292300350.5778.160.292302049.4377