液相色谱分析方法的建立

1、方法建立的步骤开始前应知道1.样品的性质在开始方法建立之前，我们应该检查自己对样品的了解程度， 并明确分离目标。表1有关样品组分和性质的重要信息所含化合物的数目化合物的化学结构官能团）化合物的分子量化合物的pKa值化合物的UV光谱图化合物在样品中的浓度范围样品的溶解度样品的化学成分能够为选择HPLC分离的最佳初始条件提供有价 值的线索根据已知的样品信息，HPLC方法建立有两种不甚相同的模 式。一种模式依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件，色谱工 作者需很大程度依赖于过去的经验 如类似结构化合物的分离）和/ 或用文献资料补充现有信息而另一种模式则直接开始色谱分离，而 对样品的性质不大注意这两种

2、HPLC的方法建立模式可分别称为理沦 型与经验型初始分离一旦开始，可以根据类似的思路理论的与经验 的）选择进一步的实验。b5E2RGbCAP2.分离的目的HPLC分离的目的必须十分明确，下面的问题在建立方法之初就 应确定：1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？；2）是否有必要解读出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中 的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将 它们彼此完全分开。plEanqFDPw3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度 通常能达到12%，特别是不需样品预处理的情况。DXDiTa9E3d4）特殊化合物可能会以不同的样

3、品形式出现 如：原料药，一种或多 种形态，环保样品等）。是否需要一种以上的HPLC方法？单一方 法分离不同形态样品是否理想？ RTCrpUDGiT5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变 得非常重要。有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代 价，如缩短柱长或加快流速。当一次分析的样品数目超过10个， 运行时间一般应控制在20min以内。5PCzVD7HxA6）将要使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温 系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运 行？ jLBHrnAILg方法建立实验开始之前，应明确对方法的这些要求。样品的预处理和检

4、测1.预处理：样品来源形式不同，可能以如下形式出现:1.预处理：样品来源形式不同，可能以如下形式出现:1） 可直接进样的溶液；：2 ）需稀释、pH缓冲、加人内标或其它定容操作的溶液；3） 必须首先溶解或提取处理的固体；。检测器，因这种检测器使用方便，且可用于大多 数样品。UV光谱数据可从文献中查找，也可通过所测样品成分的化 学结构估算，直接测得如果可拿到化合物纯品）或在HPLC分离期 间用二极管阵列检测器，或衍生化样品使检测 信号增强。LDAYtRyKfE建立分离方法选择HPLC分离模式与起始条件首先，我们要确定使用什么方法最合适；如果我们选定HPLC分 离模式，将样品分为一般样品或特殊样品。

5、一般样品为小分子典型 混合物，用近乎标准化的起始条件即可分开。而样品特殊需用特殊 的色谱柱和特定的条件才能很好地分离。Zzz6ZB2Ltk一般样品可进一步分为中性或离子样品。离子样品包括酸、碱、两性化合物和有机盐类（电离的强酸或强碱 。如样品为中性， 一般不需在流动相中加缓冲液或添加剂，但对于酸或碱性样品，通 常需在流动相中加入缓冲剂。碱性或阳离子样品，推荐用“弱酸 性”的反相色谱柱，流动相中加人胺添加剂可能对分离有利。首次 实验完成后，再按照结果系统地加以进一步完善。dvzfvkwMIl样品的性质HPLCGCCESECTLC11般样品特殊样品S.中性的离子无机离子异构体对映体生物样品等度糖类

6、异构体对映体生物样品等度糖类梯度蛋白质大分子离子正 相合成聚合物图1.利用样品的有关条件，选择初始实验分离条件表2特殊样品的处理样品要求无机离 子检测为主要问题；使用离子色谱异构体有些异构体能用反相HPLC分开，可分为一般样品类中；用 （I正相HPLC或（2环糊精 硅胶色谱柱的反相分离能较好 地分离异构体对映体分离这些化合物需要“手性”条件生物样多种因素如分子构象，极性官能团和宽范围的疏水性使这品种样品很特殊大分子“大”分子需要大孔径的色谱柱填料（N10.m孔径表3 首次HPLC分离的较好实验条件分离条件较好的首要选择色谱柱尺寸（长度，内径ID粒度固定相15x4.6cn5uma.C8 或 C1

7、8流动相溶剂A和B缓冲液一乙睛%B80100%b.缓冲液（化合物、pH、浓 度25mM 磷酸钾，2.0pH3.0c.添加剂（如胺改性剂、离子 对试剂开始时不用样品大小体积V25ul重量 d. 时，仅需要分离出个别除莠剂，确定其特征保留时间进行峰鉴别即 可。6ewMyirQFL尽管大多数HPLC设备能在更高的压力下工作，使用新色谱柱的 工作压力不应超过170bar2500psi , 17MPa），压力上限最好在 2000psi 以下。kavU42VRUs限制该压力基于两点原因：第一.随着色谱柱的使用，微粒杂 质会逐步堵塞柱头，使柱压成倍升高；第二.较低的压力 170bar）适于泵、进样阀、尤其是

8、自动进样装置的稳定工作， 密封垫的寿命更长，色谱柱堵塞的情况减少，系统的耐久性明显提 高。因此，最好以小于泵的最大允许压力的50%作为目标压力。y6v3ALoS89可重现的分离在进行实验时，要能够重现每次实验色谱图。在方法建立过程 中改变实验条件流动相、色谱柱、温度）时，必须经过足够长的时 间使色谱柱在新流动相和温度下达到平衡。通常以1020倍柱体积 的新流动相冲洗色谱柱后，色谱柱可达到平衡。M2ub6vSTnP五.HPLC方法的完善最后的实验方案应达到方法建立开始时所设定的所有目标。方 法本身在日常工作中应经受住考验，应适用于所有的相关实验室以 及人员。0YujCfmUCw定量与方法论证一旦

9、完成了 HPLC方法建立，应对其进行论证，进行全面论证通 常需通过简略核查方法的专属性、线性、准确性、精密度、回收 率、灵敏度等而实施。在最终论证方法之前，应准备和检查书面分 析方案，使之清晰、严密。实际的论证程序按方法的重要性不同， 需时为1天一 2周不等。理想的情况是，通过方法论证能找出可能 因仪器和操作者的不同而导致的潜在问题。eUts8ZQVRd在日常HPLC分析中，柱间重现性可能是主要问题之一。同种方 法在不同批号的色谱柱上可能有不同的结果，任何意外的结果都应 进行研究，以找出其原因，避免在日后的工作中出现同类错误。 sQsAEJkW5T表6 完善方法应预备数据表明所需方法的性能;应

10、有为其它操作者使用的书面分析步骤；以一个以上的系统或操作者，用包括期望组分和期望被测物浓 度的样品系统地论证方法的性能；比较不同时间和不同实验室之间的实验 数据；应得到色谱柱的期望寿命以及柱间重现性的数据；研究不正常的结果，以纠正潜在的问题；研究所有影响分离的条件温度、流动相组成、pH等）；规定 这些条件的限度；对可能发生的问题关键谱峰对分离不足；随运行时间延长，最末谱峰保留值增加等）提出建议措施。备注：主要用于日常工作或质量监控方法上表的要求适用于满足精密准确、稳定可靠并可移植转让的严 格HPLC标准方法。在其它情况下，可能只要求一次成功的分离或能 快速、“粗略”地答复某一特定问题，此时可免

11、掉表5和表6中的 许多建议，图1中一些步骤也可能是不必要的，仅明白并知道一个 方法建立方案的真实目标就足够了。GMsIasNXkA解决出现的问题随着方法建立的进行，会出现各种问题，其中有些已在表7中 列出，其它的问题包括：开始时色谱图中有的谱峰可能比所期望的 要宽塔板数低），或谱峰严重拖尾；在方法应用中还会发现用同一 或不同）厂家的“规格相同”色谱柱替代原柱后，分离情况会变得 难以接受，常规实验室无法用规格相同的）另柱重复此方法；色谱 柱寿命也可能很短 如进样不足100次即不能再用）； 同一色谱 柱）重复进样的色谱图不一样，定量精度较差，保留时间从一系列 运行的开始直至结束一直漂移；在后面样品的色谱图中可能出现了 其它峰干扰被测物测定等。TIrRGchYzg表7方法建立和论证期间可能出现的问题问题评论塔板数低色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响色谱柱易变 性色谱柱选择不对，二次保留的影响色谱柱寿命 短色谱柱选择不对，样品需预处理保留值变化色谱柱平衡不够，样品需预处理，键 合相流失定量精度差需更好地校正，找出误差的来源出现新的千 扰峰初始分离不够或初始样品无代表性对于将长期使用的常规方法，最好在正式应用之前，对这些问 题进行预测并加以改善。进人日常应用后才发现方法性能不好是不 愿看到的情况，方法重现性差会影响质量控制或生产