04药物的含量测定方法与验证

1、药物分析主讲: 罗容珍Pharmaceutical Analysis第四章 药物的含量测定方法9/9/2022前言药物的含量测定是指药物中所含的主成分的量，是评价药物质量的重要指标。定义9/9/2022前言药物的含量测定化学、物理学、生物学、微生物学方法基础 在规定条件下选用适当微生物测定某物质含量的方法。被测定的物质可以是某些生物生长所必需的维生素、氨基酸等，也可以是抑制某些微生物生长的抗生素、农药等。常使用的有液体稀释法和固体平板扩散法。 利用某些生物对某些物质如维生素、氨基酸)的特殊需要，或对某些物质如激素、抗生素、药物等)的特殊反应来定性、定量测定这些物质的方法。 化学反应如UV光吸收

2、特性、浊度9/9/2022前言药物的含量测定基于化学或物理学原理的含量测定。分两类基于生物学原理的效价测定。基础生物检定法，微生物检定法，酶法。目标本章的目标：含量测定。P40：效价测定方法：凡以生物学方法或者酶学方法对药品中的特定成分以标准品为对照，作量反应平行线测定方法进行的生物活性（活力）测定量反应平行线测定方法：同时测定供试品和标准品的剂量反应曲线，且两条反应线必须具有平行性，即供试品和标准品的活性只有量的区别，并无质的区别9/9/2022前言药物的含量测定容量分析法三种分析方法光谱分析法色谱分析法特点操作简单、结果准确，耐用性高，但专属性差特点特点简便快速、灵敏度高，有一定的准确度，

3、但专属性稍差灵敏度与专属性都高，有一定的准确度，但结果需要对照品适用于准确度与精确度要求较高的样品测定适用于灵敏度要求较高，样本量较大的分析项目适用于专属性和灵敏度要求较高的复杂样品9/9/2022第一节 定量分析方法的分类与特点容量分析法定义将已知浓度的滴定液（标准物质溶液），由滴定管滴加到被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（通过适当的方法指示），然后根据滴定液消耗的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系式计算出被测药物的含量。亦称滴定法通过指示剂颜色变化，或者电子设备的电位或电流突变来指示滴定终点滴定终点和计量点不一致，就会引入滴定误差，应该尽量避免。特点适用范围1、方法简便易行：

4、所用仪器价廉易得，操作简便快速广泛应用于化学原料的测定，较少应用于药物制剂的测定2、方法耐用性高：影响测定的试验条件与环境因素少3、测定结果准确：误差低于0.2%，满足准确度高样品4、方法专属性差：对相近杂质干扰缺少选择，适用于主成分含量较高的样品分析?9/9/2022第一节 定量分析方法的分类与特点容量分析法有关计算滴定度每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物质量。中国药典用毫克（mg）表示。例如用碘量法测定维生素C的含量时，中国药典规定：每1ml碘滴定液（0.05mol/L）相当于8.806mg的维生素C（C2H8O6）9/9/2022第一节 定量分析方法的分类与特点被测药物滴定液容量分

5、析法有关计算滴定度计算用B来滴定A滴定液反应的质量被测药物反应的质量被测药物的摩尔质量滴定液的摩尔质量9/9/2022第一节 定量分析方法的分类与特点容量分析法有关计算滴定度计算用B来滴定A滴定液待测液等于1ml浓度乘体积=nB计算有一个从质量到物质的量，再到浓度再到滴定度的转变过程浓度mB9/9/2022第二节 定量分析方法的特点示例一 计算Vc的滴定度T碘量法测定Vc含量M(C6H6O6)=176.13，C(I2)=0.05mol/LMb=0.05mol/L11MA=176.139/9/2022第二节 定量分析方法的特点示例二 异烟肼的滴定度溴酸钾法测定异烟肼含量M(C6H7N3O)=13

6、7.14，C溴酸钾=0.01667mol/Lab9/9/2022第二节 定量分析方法的特点直接滴定法间接滴定法直接滴定法在实际工作中，滴定液的浓度可能与药典规定的浓度并不一致，所以应该进行校正9/9/2022第二节 定量分析方法的特点直接滴定法的含量计算方法直接读取药典规定自己标定取样量9/9/2022第二节 定量分析方法的特点间接滴定法不直接对待测物进行滴定，而采用间接途径滴定生成物滴定法剩余量滴定法被测药物与化合物A作用生成 化合物B，再用滴定液滴定化合物B也称回滴法，本法先加入定量过量滴定液A与药物作用，再用滴定液B与剩余的滴定液A反应，然后再进行含量计算9/9/2022第二节 定量分析

7、方法的特点间接滴定法的生成物滴定法注意滴定度T的计算先计算T再计算含量请看下例正确求a和b9/9/2022第二节 定量分析方法的特点示例三 葡萄糖酸锑钠的含量测定0.3g供试品水100ml盐酸15ml碘化钾试液10ml密塞，振摇后暗处放置10min碘量法Sb5+2S2O32-本法先用葡萄糖酸锑钠与碘离子反应生成碘，再用碘与硫代硫酸钠反应生成碘离子，相当于是用硫代硫酸钠在滴定葡萄糖酸锑钠，因此要找出它们两者的量反应关系，也就是a和b滴定度T的计算示例如下9/9/2022第二节 定量分析方法的特点间接滴定法的生成物滴定法注意滴定度T的计算请读取请校正9/9/2022第二节 定量分析方法的特点间接滴

8、定法的剩余量滴定法也称回滴法，本法先加入定量过量滴定液A与药物作用，再用滴定液B与剩余的滴定液A反应，然后再进行含量计算计算的关键在于求出滴定液A应用于药物反应的实际量9/9/2022第二节 定量分析方法的特点间接滴定法的剩余量滴定法也称回滴法，本法先加入定量过量滴定液A与药物作用，再用滴定液B与剩余的滴定液A反应，然后再进行含量计算计算的关键在于求出滴定液A应用于药物反应的实际量常涉及化学反应、加热、分取等操作等步骤，使测定误差显著增加空白试验校正没有药物存在时的滴定，方法步骤与有药物存在时相同计算公式相应修正如下：9/9/2022第二节 定量分析方法的特点间接滴定法的剩余量滴定法也称回滴法

9、，本法先加入定量过量滴定液A与药物作用，再用滴定液B与剩余的滴定液A反应，然后再进行含量计算计算的关键在于求出滴定液A应用于药物反应的实际量常涉及化学反应、加热、分取等操作等步骤，使测定误差显著增加没有药物存在时，滴定液A全部与滴定液B反应药物存在时，剩余滴定液A全部与滴定液B反应浓度校正作用Example as follows9/9/2022示例四 司可巴比妥钠的含量测定第二节 定量分析方法的特点 取本品约0.1g，精密称定，置250ml碘瓶中，加水10ml，振摇使溶解，精密加溴滴定液(0.05mol/L) 25ml，再加盐酸5ml，立即密塞，并振摇1min，在暗处放置15min后，注意微开

10、瓶塞，加碘化钾试液10ml，立即密塞，摇匀后，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定得的结果用空白试验校正。本法用溴与司可巴比妥钠反应，再用硫代硫酸钠反滴定溴，属反滴定法，并用空白试验校正,滴定液A为溴，B为硫代硫酸钠，含量计算只需先求溴滴定度，再求出硫代硫酸钠空白试验V0体积与样品测定体积Vs9/9/2022示例四 司可巴比妥钠的含量测定第二节 定量分析方法的特点已知：司可巴比妥钠M=260.23;司可巴比妥钠与溴反应摩尔=1:1； W=0.1022 g； 硫代硫酸钠浓度校正因子=1.038 ； 供试品滴定Vs=15.73ml ;空白

11、试验滴定V0 =23.21ml;Its very easy！9/9/2022第二节 定量分析方法的特点Notice！本公式适用于空白校正情形本公式适用于没有做空白校正情形见上例见下例见P1469/9/2022第二节 定量分析方法的特点习题一 剩余碘量法测定异烟肼含量 异烟肼在弱碱性溶液中，加定量过量的碘滴定液(0.1mol/L)氧化，反应完成后，酸化，剩余碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定(以淀粉为指示剂)。9/9/2022第二节 定量分析方法的特点习题二 非那西丁含量测定 精密称取本品0.3630g加稀盐酸回流1小时后，放冷，用亚硝酸钠液（0.1010mol/L）滴定，用去2

12、0.00ml。每1ml亚硝酸钠液（0.1mol/L）相当于17.92mg的C10H13O2N，请计算非那西丁的含量。9/9/2022第二节 定量分析方法的特点光谱分析法药典收载紫外可见分光度法原子吸收分光光度法红外分光度法荧光分析法火焰光度法本章讲叙紫外可见分光度法荧光分析法9/9/2022第二节 定量分析方法的特点紫外可见分光度法基于物质对紫外区(200400nm)和可见光区(400760nm)的单色光辐射建立起来的光谱分析法朗伯-比尔定律基础9/9/2022第二节 定量分析方法的特点紫外可见分光度法方法特点与适用范围1、简便易行：本法使用的仪器价格比较低廉，操作简单，易于普及2、灵敏度高：

13、本法灵敏度可达10-710-4g/ml，适用于低浓度试样分析3、准确度较高：本法误差在2%5%之间，适用于对测定结果的准确度要求较高的样品4、专属性较差：本法通常不受一般杂质的干扰，但对结构相近的有关物质缺乏选择性。本法比较少应用于原料药的含量测定，可用于制剂的含量测定，更多的应用于生物制剂的定量检查本法紫外区须选用石英比色皿，比色皿一般为1cm，吸光度在0.30.7之间为宜，选用最大吸收光波长。9/9/2022第二节 定量分析方法的特点紫外可见分光度法含量测定方法4种方法对照品比较法吸收系数法计算光度法比色法9/9/2022第二节 定量分析方法的特点紫外可见分光度法含量测定方法对照品比较法分

14、别配制供试品溶液和对照品溶液,对照品溶液的中所含被测药物的量应为供试品溶液中被测成分规定量的10010%,所用溶剂量两者相同,在规定的波长下测定吸光度.按下式计算结果9/9/2022第二节 定量分析方法的特点1.对照品比较法紫外可见分光度法含量测定方法对照品比较法P16:将Cx用上述公式替代，即可通过实验求出各种含量。见书例。对应于稀释体积浓度9/9/2022第二节 定量分析方法的特点1.对照品比较法紫外可见分光度法含量测定方法对照品比较法P16:制剂的标示量:系指每一支、片或每一个单位制剂中含有主药的重量(或效价）或含量或装量。P16:将Cx用上述公式替代，即可通过实验求出各种含量。见书例。

15、9/9/2022第二节 定量分析方法的特点紫外可见分光度法含量测定方法吸收系数法吸收系数法:引入吸光系数的含量计算方法9/9/2022第二节 定量分析方法的特点溶液片剂紫外可见分光度法含量测定方法吸收系数法g/mlMg转化单位请看例题9/9/2022第二节 定量分析方法的特点紫外可见分光度法含量测定方法吸收系数法例题示例：盐酸氯丙嗪注射液的含量测定：精密量取本品适量（约相当于盐酸氯丙嗪50mg），置200ml量瓶中，加盐酸溶液（91000)稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，置100ml量瓶中，用盐酸（91000)稀释至刻度，摇匀；在254nm下测定吸光度，按盐酸氯丙嗪的吸收百分系数计算，即得。

16、过程推导注射液，选溶液公式,如下：9/9/2022第二节 定量分析方法的特点紫外可见分光度法含量测定方法吸收系数法D为供试品溶液的稀释体积：共稀释了200ml1002=10000ml2ml ?9/9/2022第二节 定量分析方法的特点吸收系数法9/9/2022第二节 定量分析方法的特点吸收系数法固体试剂公式推导如下：9/9/2022第二节 定量分析方法的特点3.计算分光光度法4.比色法（可能有实验，Its very simple）看书！9/9/2022特点： 灵敏度高，可达10-1010-12g/ml 要求低浓度下测定 须做空白测定 荧光弱的药物可衍生化后测定第二节 定量分析方法的特点(二)荧

17、光分析法9/9/2022第二节 定量分析方法的特点(三)色谱分析法1.HPLC1.1 内标法 As：内标物质峰面积或者峰高AR: 对照品的峰面积或者峰高Cs: 内标物质浓度CR：对照品浓度9/9/2022第二节 定量分析方法的特点As：内标物质峰面积或者峰高Ax: 供试品的峰面积或者峰高Cs: 内标物质浓度f：校正因子9/9/2022第二节 定量分析方法的特点(三)色谱分析法1.HPLC示例一 炔诺酮的含量测定 照高效液相色谱法(附录D测定)色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(65:35)为流动相，检测波长为244nm。理论塔板数按炔诺酮峰计算不低于1500，

18、炔诺酮峰与内标物质峰的分离度及主成分峰后一杂质峰与主成分峰的分离度均应符合要求。内标溶液的制备 取黄体酮约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。9/9/2022第二节 定量分析方法的特点测定法 取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液2ml与内标溶液3ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取20l注入液相色谱仪，记录色谱仪，记录色谱图；另取炔诺酮对照品适量，精密称定，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。9/9/20222.GC第二节 定量分析方法的特点示例 松节油的含量测定 照气相色谱法(附录 E测定)色谱条

19、件与系统适用性试验 用聚乙二醇(PEG)-20M为固定相，涂布密度为20%；柱温为90C。理论塔板数按-蒎烯峰计算应低于1500。校正因子测定 取正丁醇适量，精密称定，加石油醚(3060C)制成每1ml含20mg的溶液，作为内标溶液。另取-蒎烯对照品约30mg，精密称定，置10ml棕色量瓶中，精密加入内标溶液2ml，加石油醚(3060C)至刻度，摇匀，吸取1l注入气相色谱仪，计算校正因子。9/9/2022第二节 定量分析方法的特点测定法 取本品约35mg，精密称定，置10ml棕色量瓶中，精密加入内标溶液2ml，用石油醚(3060C)溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取1l注入气相色谱仪，测定，即得。

20、本品含-蒎烯(C10H16)不得少于70%。9/9/2022外标法:标准加入法:9/9/2022第二节 定量分析样品的前处理方法不经有机破坏经有机破坏直接测定配位滴定法氧化还原滴定法水解后测定酸水解碱水解经还原分解后测定湿法破坏凯氏定氮法干法破坏高温灼烧法氧瓶燃烧法9/9/2022第二节 定量分析样品的前处理方法(一)、直接测定法 葡萄糖酸钙 EDTA配位滴定 富马酸亚铁 邻二氮菲-硫酸铈滴定 葡萄酸锑钠 间接碘量法(二)、经水解后测定法适用范围：金属原子不直接于碳原子相连或某些C-M键结合不牢固的有机金属药物。9/9/2022第二节 定量分析样品的前处理方法1、碱水解法三氯叔丁醇银量法返滴定

21、2、酸水解法适用范围：含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物。EDTA配位滴定9/9/2022第二节 定量分析样品的前处理方法(三)、经还原分解后测定法适用范围：碘原子直接与芳环连接的含碘有机化合物。碘他那酸9/9/2022第二节 定量分析样品的前处理方法三、经有机破坏的分析方法 含氮、硫、硫柳汞、氯化钠的生物制品、含氮有机合成药物测定的前处理和生物制品中金属元素测定时生物基质的去除。 H2SO4-HNO3 H2SO4-HClO4 H2SO4-H2SO4 HNO3-KMnO4分解剂/消化剂辅助分解剂凯氏定氮法测定含有氨基和酰胺结构的药物结构(一)湿法破坏9/9/2022第二节 定量分析样

22、品的前处理方法原 理 将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被“消化”成CO2和H2O，有机结合的氮转化为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，经碱化后释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。 常量法含氮量 2530mg 半微量法含氮量 1.02.0mg9/9/2022第二节 定量分析样品的前处理方法凯氏烧瓶K2SO4(提高消解温度)CuSO4(加快消解速度)硫酸碱液硼酸(吸收液)甲基红-溴甲酚绿指示剂硫酸滴定空白校正先用强酸水解再用含碱硫代硫酸钠中和最后用碱释放出氨气 ，并蒸馏出之9/9/2022(二)干法破坏1.高温灼烧法用于含

23、卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。2.氧瓶燃烧法第二节 定量分析样品的前处理方法 系指将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭的密闭的燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为CO2和H2O，待测元素根据电负性的不同转化为不同价态的氧化物，被吸收于适当的吸收液中，再根据其性质和存在方式选择方法进行分析。9/9/2022第二节 定量分析样品的前处理方法燃烧时待测物转化成不同价态的无机物以供测定 滤纸包装样品9/9/2022第三节 药品分析方法的验证药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则药物稳定性试验指导原则缓释、控释制剂指导原则微囊

24、、微球与脂质体制剂指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则目的： 证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求效能指标： 评价分析方法的尺度 效能指标包括: 精密度, 准确度, 检测限,定量限,选择性, 线性与范围, 耐用性9/9/2022第三节 药品分析方法的验证一、准确度（accuracy） 系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。(一)含量测定方法回收率(Recovery)回收试验加样回收试验33，至少9个测定结果9/9/2022第三节 药品分析方法的验证二、精密度(Precision) 系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之接近的程度。表示：偏差(d)、标

25、准偏差(s),、 相对标准偏差(RSD)重复性: 同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度: 同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度 重现性: 不同实验室，不同人测定的精密度9/9/2022第三节 药品分析方法的验证三、专属性(Specificity) 指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。目视法信噪比法 S/N=3四、检测限(Limit of Detection, LOD)药物能被检出的最低浓度(g/ml)五、定量限(Limit of Quantitation, LOQ)药物能被定量测定的最低浓度(g/ml)信噪比法 S/N=109/9/2022第三节 药品分析方法的验证影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等六、线性与范围(Linearity And Range)待测结果(响应值)与试样中被测物的浓度或量直接成正比关系的程度。 Y=a+bx （r=0.9999)七、耐用性(Robustness