DB12-T199-2004以大豆为原料的酱油等发酵产品中转基因成分的定性检测方法

1、77ICS 65.020.01B04备案号：DB12/T 1992004以大豆为原料的酱油等发酵产品中转基因成分的定性检测方法alitative detection for transgenic component in fermentedProtocol of the qu;alitative detection for transgenic component in fermentedproducts(soy sauce etc) produced ftom soybeans2004-07-22004-07-28 实施2004-07-2天津市质量技术监督局发布DB12/T 1992004D

2、B12/T 1992004本标准在制有 用了欧盟推荐的用Brodmann, P. S7d本标准在制有 用了欧盟推荐的用Brodmann, P. S7d本标准由天舊 本标准起草車 本标准主要用于检测#大豆为原料的酱油等发酵制品中的内源基因和外源基因的引物序列时，采 测方法，项目编号为EU-Project SMT4-CT96-2072,方法编号为Brodmann, P. 97c和 !检测Ca* 35S启动子的引物序列(195bp)和NOS终止子的引物序列(180bp), :市农产品#量监督检验测试中心提出。位:天津卄农产品质量监督检验测试中心、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 章人：金公、赵昕

3、、王永、程奕、郑贵忠。1范围以大豆为原料的酱油等发酵产品中转基因成分的定性检测方法本标准规定（简称为PCR）本标准适用炉攻转基因抗|草甘麟大豆、转基因抗草丁麟大豆和转基因高油酸大豆为原料的发酵制品 中转基因成分的油等液声发酵制品和豆腐乳等固态发酵制品中转基因成分的定性聚合酶链式反应 检湖方法。T1定性PCR检测。下列文件中2规范性引用丈的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括申端的内容）*修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 66

4、82SN/T1193SN/T 1194SN/T 12043术语、定义？T语下列术语、舄33.1转基因成分物种本身不具3.2聚合醺链式反模板基因序列 计的两条引物分别 酶的作用下以四利瑯 伸这一循环，使欲3.3定性检测）u析实验窒 因检验实 物及其产 物及其加用水规格和试验方法验室技术要求 品转基因成分检测的抽样和制样方法I工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法和缩略语笹用于本标准。ansgenic 的、而是*源于其他物种的功能基因序列。polymerase chain reaction （PCR）空高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设 莫板DNA核糖核#

5、 （dNTP s）为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延 的基因片段以几彳可倍数扩增。litative detectioncomponent两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合对样品中转基因成分进行检测，以判定该样品是否为转基因产品。3.4缩略语3. 4. 13. 4.23. 4.33. 4.43. 4.53. 4.63. 4.7脂碱合成酶基因终GMO： genencally modified organism,转基因生物。11PCR： pol /merase chainDNA： deoxy dNTPs： d Lectin：植，CaMV35SNOS： Te

6、rniiiktor of nopreaction,聚合酶链式反应。acid,脱氧核糖核酸。ibonucleic/ribonucleoside triphasphate,脱氧核甘三磷酸。 展集素基导，为大豆本身含有的内源基因。5S promoti:er from cauliflower mosaic virus,花椰菜花叶病毒 35S 启动子。|aline synthase gene from Aagrobacterium tumefaciens,来源于农杆菌的胭DB12/T 1992004DB12/T 1992004223. 4.8 CP4 EP 酶基因。3.4.9 GTS 40-:5-eno

7、lpyirruvylshimate-3-phosphate synthase gene, 5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成3-2：美国Me基因有CaMV35S启动子，N（nsanto公司的获准商品化种植的抗除草剂草甘麟的转基因大豆，转入外源 3S终止子和CP4-EPSPS基因等。防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T 1193中的规定执行。抽样和制样按照 SN/T 1194中规定的方法进行。测定方法6.1原理液态和固态大豆 引物，通过聚合應令殳酵制品经过提取SIA后，根据加工用的转基因大豆原料所插入的外源基因设计 式反应（PCR）技术，特异性扩增外源基因的DNA片断，根据PCR扩

8、增结果，判 断该发酵制品中是奔含有转基因成分。6.26. 2.6.2.6.2.6. 2.6. 2,6. 2.6.2.6. 2.6. 2.6. 2.6. 2.6. 2.6. 2.6. 2.6. 2.6.2.6.3主要仪器电子天* （感量分别*0.01g和O.OOOlg）。 :恒温水*装昌。;低温超速离上机，台*冷冻离心机。研钵及粉；，普通冰箱，磁力搅拌：高压灭菌I高温干燥微量移液基因扩增側12345678910111213141516试剂和材料碎装置。，超低温冰箱。器a 锅?箱9 器(0.1 2.5 虬，1 10PL, 10-100 L, 100 1000 PL)。电泳槽及电 凝胶成像分 超净工

9、伫 实验用水雨 液氮罐旋涡震荡器，泳仪。析系统或紫外透射分析仪。装置。除另有规定外 实验用水为I级。6. 3. 16. 3.26. 3.36.3.46. 3.56. 3.66. 3.76. 3.8所使用试剂为分析纯或生化试剂，配制好的溶液经高温灭菌后使用（有机溶剂除外）。漠代十六烷： 三羟甲基氯專甲烷（Tri 二水乙二波试乙酸二钠聚乙烯毗咯3三氯甲烷。三甲胺（CIAB)oS)o(EDTA-Na- 2H2O)o，酮（PVP：异戊醇。 异丙醇。 三氯甲烷:异戊醇=24:1（体积比）。DB12/T 1992004DB12/T 1992004 DNA提取。6. 4.1.2 CL取经预刘：时，期间每隔入

10、等体积的三，体积的三氯甲|烷异戊醇（. 3.8）重复抽提一次，取上清，加入2倍体积的CTAB沉淀液（6.3.11）, 置.小时，12,直温静置5 Lin,加入等体积三氯甲烷+异戊醇（6. .8）颠倒摇匀Imin, 12 000 r/min离 上亩，加入“的3mol/L乙酸钠（6. 3.13）和等儲R的冷异丙醇（6.3.7）,缓慢混匀，离心15 min,弃上清，加入400 70%冷乙醇（6. 3.9）洗涤沉淀，除去残加入30卩L灭菌的去离子水溶解DNA （6. 3.19）沉淀，-20C保存备用。法提取DNA理敢样品加入10 mL经65C预热的CTAB提取缓冲液（6. 3. 10）,摇匀。65C水

11、浴1小1 min轻轻用倒混匀一次，取出静置冷却至室温，12 000 r/min离心12 min,取上清，加氯草烷+异戊醇（6. 3. 8）缓慢颠倒摇匀5min, 10 000 r/min离心10 min,取上清，加入等摇匀，室温静 ImL溶解沉淀 心10 min,取4 C静置过夜,000 r/min 离心 10 min,弃上清，沉淀加入 1.2 mol/LNaCl 溶液(6. 3.12)14 000 r/min 留的乙醇，待忡|干燥后，6. 4.2样品中N釆用内源基E6.4.3定性FCR检测 6.4. 3.1 PCR*应体系检测以大豆才原料的发静制品中内源基因和外源基因釆用的PCR检测体系见表

12、20反应体系中各 试剂的量根据帷体系的总榻2 PCR检测参考反应体系（25叫体系）认质量网鉴定扩增法鉴定所提取的样品DNA的质量。通过PCR技术，扩增大豆内源基因。积进行适当调整。每个反应体系应该设置两个平行管。PCRlOxPCR 2.5 ML（2!mrlol/L)2.0 HLdNTP2.5 mmolJ)2.0 HL101|mol/PL)2.510|mol/ML)2.5 WLTaq (2UPL2.0,NA)810L25DNAIMLo6. 4. 3. 2反应作鳳对照的设置进行PCR检料中提取的DN/、饵为PCR凤应体系的tNA模板；阴性对照：用非转基因大豆材料中提取的DNA为 模板；空白对照；6

13、. 4. 3. 3 样品 4以大豆为原：检测仪器的性能测时反应体耒必须设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：用转基因大豆材i田I:做配置反曆体系的实验用水代替模板。原基因和源基因旬检测样品的内#基因和井源基因的PCR检测的参考反应条件见表30反应条件需根据 I应调整。艮3样品中内源基国和外源基因的PCRDB12/T 1992004DB12/T 1992004CP4E1s)4C, 3 min94C, 30s60C, 40s72C, 60s4072C, 7 minP-35S/CTEPSPofPSCP45*C, lOmin95C, 30s62C, 30s72C, 25s4072C, 3 min

14、表3 （续）6. 4. 3. 4族胶电桃检测PC 电*缓冲液常 :呻将10卩L 子*标记物， 成畚分析（照相）R产物i备2%的琼脂糖凝胶.（凝胶融化后晾至60C左右时加入漠化乙锭，含量为 的PCR产杨与上样缓冲液均匀混合，然后加入对应的凝胶孔中，同时加入 选择合适的电压（3 V/cm5 V/cm）进行电泳，电泳时间为40 min60 min。用 1XIAE0. 5g/mL）o 按合适的DNA分6. 4. 3. 5 凝肢电泳结束后，.恠琼脂糖率胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标记判断扩 增出的目的条带旳*小，将有泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。6. 4.4结果分析6

15、. 4. 4. 1内源基0对于大豆特异 出现118bp的条带 则不能用于检洲 生假阴性。6. 4. 4. 2外源对待测样品| D*A提取液均业现预期*小的扩增条带，则可判断待测样品中舍有外源基因。酵帛品中转基性可直接报首结果。訊阳性，则判定的检测主内源基Si Lectin片段的检测，如果阴性对照、待测样品和阳性对照的PCR产物都 则表明*取的待测样品DNA符合PCR反应的要求，能用于外源基因的检测；否 京基因，&该重新提取待测样品DNA,直到能扩增出118bp的条带，防止检测中产的检测进行外源華因的PCR检测，如果阴性附照和空白对照未出现条带，阳性对照和待测样品对酱油等发筛选检测结果阴若筛选检测源基因 CP4 EPS|S 伞 P-35S/C以判定此待测样品为GTS 40-2待测样品的为*基因Lectin扩增为阳性，该样品的外源基因CaMV35S、NOS、CP4 EPSPS或 *为阳性，“定被检样品的检测结果可疑，应重新检测。因成分的检测，可参考表1的内容，先筛选检测CaMV35S、NOS基因,需进一步鉴定检测外源目的基因片段CP4 E