非小细胞肺癌基因检测PPT

1、关于非小细胞肺癌基因检测第一张，PPT共二十七页，创作于2022年6月前言随着分子医学进展和靶向药物的不断涌现，晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗已进入到个体化治疗的时代。目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对EGFR突变型和ALK融合基因型肺癌,这两种基因变异型肺癌均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效得到明显提高。第二张，PPT共二十七页，创作于2022年6月EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念2、基因突变是指DNA发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非DNA的检测手段如：RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及针对非碱基序列的检

2、测手段如：FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用。体细胞突变发生在非种系组织中不具有遗传性不会遗传给子代种系突变发生于精子或卵子中可以遗传子代子代所有细胞均带突变1、EGFR突变为体细胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。第三张，PPT共二十七页，创作于2022年6月EGFR基因突变检测概念EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态检测并不是：EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法）EGFR蛋白表达量的检测（IHC法）。EGFR检测检测物质部位方法基因突变DNA

3、细胞核测序法、ARMS法等拷贝数DNA细胞核荧光原位杂交法（FISH）蛋白表达蛋白质细胞膜免疫组化法（IHC）RNA表达RNA细胞核RT-PCRX第四张，PPT共二十七页，创作于2022年6月Nature Review 2007, 7:169NSCLC中EGFR酪氨酸激酶区突变种类第五张，PPT共二十七页，创作于2022年6月第六张，PPT共二十七页，创作于2022年6月标本采集及病理评估DNA 抽提及质控检测报告EGFR突变检测ARMS测序法其它方法EGFR 突变检测流程第七张，PPT共二十七页，创作于2022年6月EGFR突变检测中的相关角色患者临床医生胸外科医师内镜医师收集肺癌组织标本病

4、理科医生准备样本实验操作及结果分析实验室人员报告结果给临床医生肿瘤科医生放疗科医生呼吸科医生第八张，PPT共二十七页，创作于2022年6月用于EGFR突变检测的标本肿瘤组织目前最可靠的标本；其它样本： 外周血（血浆、血清） 细胞学 （胸水、痰液细胞学） 支气管刮取物 仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用第九张，PPT共二十七页，创作于2022年6月标本问题石蜡组织：尽可能送检一年内的石蜡标本。石蜡切片：含肿瘤细胞越多越好（50%以上）；组织部位面积约6mm x 6mm以上；包埋组织：组织块不小于0.50.50.5（cm）。新鲜组织：比石蜡等处理过的旧组织，DNA保存得更完整，对P

5、CR实验更有利，但一定要经病理学确认。含有肿瘤组织50%以上；重量10g（约米粒大小以上），经PBS或生理盐水冲洗干净。取癌组织的中心位置组织块（避开坏死区域），固定于10%中性福尔马林溶液中，尽快送病理科。细胞学标本：可用原发灶与复发灶：只要能获得足够的癌细胞，均可；但对于复发的患者，再次活检不仅可确诊，还可以获得分子标志物的进一步信息。第十张，PPT共二十七页，创作于2022年6月标本因素对EGFR突变检测的影响-肿瘤组织特点-遗传异质性 对检测方法敏感度有较高要求正常细胞混杂第十一张，PPT共二十七页，创作于2022年6月标本因素对EGFR突变检测的影响-组织标本种类- 对检测方法有相应

6、要求，组织标本及DNA质控尤其重要 冰冻新鲜组织 固定包埋组织-外科手术标本完整，量多广泛-小活检标本完整，量少受限-外科手术标本片段化，量多受限-小活检标本片段化，量少极度受限DNA质与量适用方法第十二张，PPT共二十七页，创作于2022年6月图4. EGFR基因检测使用的临床样本及其操作。A.被切成10微米的石蜡包埋标本。B.在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净（悬浮），可以就这样冷冻保存，C.进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于AL缓冲液，此状态可以室温保存。 第十三张，PPT共二十七页，创作于2022年6月肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本病理学评估组织切片非小细胞性肺癌诊断

7、及类型肿瘤细胞比例肿瘤细胞总数标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞H&E 染色片用于病理评估白片用于提取DNA建议最少切片数：-手术标本，5 m X4-小活检标本，5 m X8 组织标本来源手术标本支气管下活检经皮穿刺活检 标本处理及贮存新鲜冻存：液氮或-80CFFPE第十四张，PPT共二十七页，创作于2022年6月检测方法目前 EGFR 基因突变的检测方法很多DNA 直接测序法应用广泛，可检测已知的突变和未知的突变，但对标本的肿瘤细胞含量要求较高，一般要求标本中肿瘤细胞的比例在 50% 以上，至少不低于 30%。基于实时荧光定量 PCR 基础上的方法（如 ARMS 法）较直接测序法更加敏感，可检测

8、样品中 1.0%0.1% 的突变基因，更适合用于肿瘤细胞含量较少的小标本检测。ARMS 方法操作简单，是目前临床上较常用的方法之一，但只能检测已知的突变，且标本需进行预处理，检测费用较高。第十五张，PPT共二十七页，创作于2022年6月直接测序法流程及数据分析PCR*纯化测序反应测序仪毛细管电泳纯化数据分析EGFR deletionEGFR L858R电泳质控组织标本DNA*PCR是关键：-特异性-产物长度-必要时巢式-建议通用测序引物第十六张，PPT共二十七页，创作于2022年6月DNAARMS反应实时定量 PCRARMS法操作流程及数据解读数据分析内参信号 (HEX)突变信号: + -内参

9、信号: + +标本 1（突变阳性）标本 2（突变阴性）突变信号 (FAM)组织标本内参信号 (HEX)第十七张，PPT共二十七页，创作于2022年6月测序法与ARMS法比较测序法ARMS敏感度20-30%1%FFPE标本成功率低高检测流程复杂慢长简单快速数据分析要求高低假阳性机会(交叉污染)多少假阴性机会多少仪器成本高低商用试剂盒无有试剂成本低略高第十八张，PPT共二十七页，创作于2022年6月小结：了解你的标本-新鲜/冰冻组织FFPE组织-手术标本小活检标本选择合适的方法-ARMS是目前较敏感快速方法，且容易开展-测序是传统的方法，但敏感度有限，过程复杂，不易普及做好组织标本及DNA质控是关

10、键非肿瘤组织标本的有效利用-在无肿瘤组织情况下，外周血cfDNA、胸水及细针穿刺等细胞学标本均可用于检测EGFR突变，但其确切的敏感度与特异性尚需进一步探索-必须选择足够敏感的方法第十九张，PPT共二十七页，创作于2022年6月EGFR激酶抑制剂的耐药性作为临床上的最大问题，吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均产生耐药。其中50%患者是在缺失或L858R等的敏感性突变的基础上，又发生了第790位密码子苏氨酸向蛋氨酸的突变（T790M）。在EGFR-TKI治疗前很少存在T790M（13%22），这种情况下TKI难以有效。另外50%患者中，其中大约一半患者的耐药性是由MET基因扩增引起的，EGFR

11、-TKI抗药性出现时再进行基因检测，可以选择与其耐药机制相对应的治疗方法。即在一个患者的各种临床情况中，掌握EGFR与相关基因的信息，以期进一步改善临床疗效。 第二十张，PPT共二十七页，创作于2022年6月EGFR激酶抑制剂耐药的处理原则对于缓慢进展的患者，建议继续使用原来的 EGFR-TKI 治疗或 EGFR-TKI 联合化疗；对于快速进展的患者，推荐停用 EGFR-TKI，改用化疗；于局部进展且原有病灶控制良好的患者，建议继续使用 EGFR-TKI 并联合局部治疗。第二十一张，PPT共二十七页，创作于2022年6月EGFR激酶抑制剂耐药研究进展第一代EGFR抑制剂Gefitinib (易

12、瑞沙, Iressa)和Erlotinib (特罗凯, Tarceva) 随着其在临床上的广泛应用，耐药问题日益突出。其中，EGFR-T790M突变约占临床耐药病人的60%以上。第二代EGFR抑制剂Afatinib(阿法替尼)。于2013年9月FDA批准上市，于2014年1月在3期临床研究中以失败告终。Afatinib在体外对EGFR-T790M突变有活性，但临床仍然未能克服T790M突变产生的耐药性。第三代EGFR抑制剂。国外多个制药公司和研究机构都在开展对T790M突变的小分子抑制剂研究，其中包括克洛维斯肿瘤公司的CO-1686和阿斯利康的AZD9291, 但还没有针对该突变的药物上市。第

13、二十二张，PPT共二十七页，创作于2022年6月 ALK 融合基因是新发现的 NSCLC 驱动基因，其中棘皮动物微管相关类蛋白 4（EML4）基因与 ALK（间变性淋巴瘤激酶）的融合（EML4-ALK）为最常见类型。ALK 融合基因主要出现在不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者，且通常与 EGFR 基因突变不同时存在于同一患者。NSCLC 患者中 ALK 融合基因的发生率约为 5%，而在 EGFR、KRAS、HER2 或 TP53 等基因无突变的 NSCLC 患者中，ALK 融合基因阳性率达 25%；我国 EGFR 和 KRAS 均为野生型的腺癌患者中 ALK 融合基因的阳性率高达 30%42% 。病理

14、形态学研究提示在含印戒细胞的粘液型或实性腺癌中，ALK的发生率高于其他类型的肺腺癌（46.2% vs 8%）ALK阳性的NSCLC虽然仅占全部NSCLC的5%，但是每年新发病例数在中国仍接近30,000例ALK融合基因概念第二十三张，PPT共二十七页，创作于2022年6月目前检测 ALK 融合基因的常用方法主要有荧光原位杂交技术（FISH）、基于 PCR 扩增基础上的技术和免疫组织化学方法（IHC）。FISH 目前仍是确定 ALK 融合基因的参照标准方法，但价格昂贵，操作规范要求较高，尚不适用于 ALK 阳性患者的筛查。实时荧光定量 PCR 操作简便，敏感度高，但需要特定的试剂盒和仪器。IHC

15、 简便易行、价格便宜、操作方法成熟。VentanaALK 融合蛋白 IHC 诊断试剂盒在不影响特异度的前提下，进一步提高了敏感度，与 FISH 结果的吻合率达到 98.8%，可重复性达 99.7%，已经获 CFDA 批准用于诊断 ALK 阳性的 NSCLC 患者。ALK融合基因检测方法第二十四张，PPT共二十七页，创作于2022年6月ALK融合基因阳性有效靶向药物针对ALK靶点的小分子抑制剂克唑替尼（Crizotinib）是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂，可特异性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。临床试验显示对于ALK阳性的晚期NSCLC患者，克唑替尼的疗效显著优于传统化疗，二线单药治疗患者的中位PFS为7.7个月，有效率达到65.3%4。基于其良好的疗效和耐受性，2013年初，中国食品和药品监督管理总局（CFDA）已批准克唑替尼用于治疗ALK融合阳性的局部晚期或转移性NSCLC患者常见不良反应（发生率25%）包括视力障碍、恶心、腹泻、水肿及便秘等第二十五张，PPT共二十七页，创作于