高效液相色谱法高效液相色谱仪

1、第十章高效液相色谱法第一节 固定相和流动相第二节 高效液相色谱仪第三节 液-固色谱法第四节 化学键合相色谱法第五节 离子交换色谱法第六节 尺寸排阻色谱法第七节 分离方式的选择及应用 high performance liquid chromatograph,HPLC2022/9/181色谱法分类示意图2022/9/182概述 高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱的基础上70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。 现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现了自动化 操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱

2、效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。2022/9/183一、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长 无法在线检

3、测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径17% 分配色谱 硅胶失活载体 吸附的水固定液2022/9/1846第四节 化学键合相色谱法一、概述二、化学键合相三、反相键合相色谱法四、正相键合相色谱法2022/9/1847一、概述 将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相。尽管选用与固定液不互溶的溶剂作流动相，但在色谱过程中固定液仍会有微量溶解。以及流动相经过色谱柱的机械冲击，固定相会不断流失，即使将流动相预先用固定相液体饱和或在色谱柱前加一个前置柱，使流动相先通过前置柱，再进入色谱柱，但仍难以完全避免固定液的流失。 2022/9/1848续前 70年代初发展了一种新型的固定相化学键合固定相

4、。这种固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。2022/9/1849 根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。在极性键合相色谱中，由于流动相的极性比固定相极性要小，所以极性键合相色谱属于正相色谱。弱极性键合相既可作为正相色谱，也可作为反相色谱。但通常所说的反相色谱系指非极性键合色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。2022/9/1850二、化学键合相 化学

5、键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。2022/9/1851键合相可分为四种键型：A 硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相 将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（=Si-O-C=）键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。B 硅氮型（=Si-N=）键合相 如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。202

6、2/9/1852C 硅碳型（=Si-C=）键合相 将硅胶表面氯化后，使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。D 硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）键合相 将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。2022/9/1853三、反相键合相色谱法 在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称O D S或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。 目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另

7、一种认为属于吸附色谱。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。 分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水+有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。2022/9/1854 吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极

8、性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。 一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。 2022/9/1855四、正相键合色谱法 在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-C N）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以

9、调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。2022/9/1856 一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比k值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。 该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。2022/9/1857化学键合色谱具有下列优点： A. 适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。 B. 由于

10、键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。2022/9/1858续前C. 键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。D. 固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。2022/9/18591分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液极性NLLC 固定液非极性RLLC3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 固定相极性 底剂

11、+ 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF2022/9/18624流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，k，组分tR5出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）（三）正相键合相色谱1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力2固定相：极性大的氰基或氨基键合相3流动相：极性小（同LSC） 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇2022/9/18634流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱

12、6适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等2022/9/1864第五节 离子交换色谱法一、原理二、固定相三、流动相四、离子色谱法ion-exchange chromatograph2022/9/1865 离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，因此应用范围较广。 2022/9/1866一、原理 离子交换色

13、谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下： 阳离子交换： 阴离子交换： 一般形式： R一AB RBA2022/9/1867对于阳离子交换树脂，一价离子的选择性顺序为： Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价离子的顺序为： Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+对于阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为： ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3

14、-H2P04-IO3-CH3COOF2022/9/1868二、固定相 作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分（见下表）表10- 2 离子交换剂上的官能基2022/9/1869 常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种： 1. 多孔型离子交换树脂 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为520m，有微孔型和大孔型之分2. 薄膜型离子交换树脂 它是在直径约为30m的固体情性核上，凝聚12m厚的树脂层。3. 表面多孔型离子交换树脂 它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂

15、一层很薄的离子交换树脂。2022/9/18704. 离子交换键合固定相 它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。 2022/9/1871三、流动相 离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。 关于pH值的影响，要

16、视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留值增大。 2022/9/1872四、离子色谱法 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。 离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号淹没而无法检测。为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术：2022/9/

17、1873续前 他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离柱后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：2022/9/1874 R+OHH+Cl- R+Cl十H2O R+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl- 由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳

18、离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的2.6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。 2022/9/1875续前 在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来，Frits等人提出采用非抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如110-4510-4molL-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。2022/9/18761.离子色谱法原理 离子色谱原理，与传统离子交换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子

19、交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。2022/9/18772.离子色谱具有以下优点（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；（2）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2022/9/18783. 离子色谱法装置：2022/9/1879第六节 尺寸排阻色谱

20、法一、原理二、固定相三、流动相size- exclusion chromatograph2022/9/1880 尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。 2022/9/1881尺寸排阻色谱具有其他液相色谱所没有的特点： （1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。(2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器。（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别

21、必须大于10才能得以分离。2022/9/1882一、原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学惰性多孔物质凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其渗透过程模型见图20-7。 2022/9/18832022/9/1884 二、固定相 排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。 所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过

22、交联而具有立体网状结构的多聚体。 1. 软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。 2022/9/18852. 半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。3. 刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等；它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速1cm3s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分

23、离。2022/9/1886三、流动相 排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。 以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品， 以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。2022/9/1887第七节 分离方式的选择及应用 choice of separation types and applacations of HPLC 一、相对分子质量二、溶解度三、化学结构四、应用2022/9/1888色谱分离类型的选择 要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。 选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分