基因工程中常用的酶课件

1、第二章 基因工程中常用的酶 第一节 限制性核酸内切酶 (Restriction enzyme) 一. 限制与修饰: 1962年 Arber, W(瑞士).等 提出限制与修饰假说。 1968 Arber 等发现型限制性酶。 1968 Smith和Wilcox K.W.发现了类限制性酶 并阐明其性质。 1971 Nathans等首次制作酶切图谱。 因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年度诺贝尔生理学和医学奖。1962 , Arber, 1968 Smith 发现限制性酶 W. Arber (1929 ) H. O. Smith (1931 ) Biozentrum der Unive

2、rsitt Basel, Johns Hopkins University School Switzerland of Medicine,USA 二.限制性内切酶的类型四.同裂酶(isoschizomers): 切割同一靶序列而来源不同的酶。 Mbo I : GATC GATC CTAG CTAG Bam HI : G GATCC CCTAG G G GATCC CCTAG G第二节 分子克隆中常用的酶一.连接酶 (DNA ligase) 在E.coli和动植物细胞中都有此酶。能催化DNA 中相邻的3-OH和5-P之间形成磷酸二脂键。 二.甲基化酶(methylase)可使DNA甲基化。有两种

3、： dam 甲基化酶和dcm甲基化酶 N6A甲基化 5GmATC3 C5C甲基化 CmCAGG 或 CmCTGG 用途：保护待克隆的片断。 例如构建真核DNA文库时用E.coli甲基化酶修饰DNA片断中的EcoRI酶切位点，然后将修饰的片断与人工EcoRI接头连接，接头用EcoRI切割后，将DNA片断插入噬菌体DNA中。三.DNA聚合酶I(DNA lolymerase I )DNA pol I 单链多肽，MW109kD,可被枯草杆菌蛋白酶切成两段；C-端大片断(Klenow 酶)，MW76kD,具53聚合酶和3 5外切酶活性，N-端小片断MW36kD,具53外切酶活性。 (一)聚合酶活性： M

4、g2+ DNA ndNTP DNA(pdN)n+nPPi 5 CCGOH Mg2+ 5 CCGATACC 3GGCTATGG 3GGCTATGG(二)外切酶活性(2) 53外切酶活性: 切补作用 从游离的5端降解DNA，对DNA双链部分的磷酸二脂键有切除功能，每次切10nt 5 CGCATCT Mg2+ 5 CATCT 3GCGCGTAGA 3GCGCGTAGA(3) 3 5外切酶活性: 校对作用从游离的5端降解dsDNA和ssDNA 5CGCATCT Mg2+ 5CGC 3GCG 3GCG四 .末端转移酶(terminal transferase) 取自小牛胸腺,催化脱氧核苷酸与DNA的 3

5、-OH结合 模板/引物或底物是带有3-OH基的ssDNA或带有突出的双链DNA。不要求模板。 Mn2+ 或Mg2+ ssDNAOH+ndNTP DNA-(pdN)n+nppi Co2+ dsDNAOH+ndNTP DNA- (pdN)n+nppi用途：(1)在载体和cDNA上加互补的同聚物接头(Homopolymeric tail) AAAAA AAAAA TTTTT TTTTT(2) 用32P进行3端同位素标记 六. 核酸酶S1(nuclease S1)从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提纯得到的一种金属蛋白，是单链特异性核酸酶。 ssDNA or ssRNA pH4.5 Z

6、n2+ 5pdN 5prN中等量的酶会在缺口或 small gaps切断dsDNA pH4.5 Zn2+用途：(1)分析RNADNA杂合结构；(2)除去DNA的单链末端，生成平端；(3)切断双链DNA 的发夹结构。七.核酸酶 Bal 31具两种活性：(1)双链特异外切酶活性；从dsDNA的3和5切除寡核苷酸或单核苷酸；EGTA(乙二胺四乙酸) 可终止反应(2)单链特异内切酶活性：专门从单链DNA切除带有5末端的单链核苷酸和寡核苷酸(类似于核酸酶S1的单链特异性核酸内切酶活性) Ca2+ Ca2+ Ca2+ 用途：1.切除dsDNA的末端核苷酸，使DNA的分子变小，在T4连接酶的作用下连接接头和载体。2.绘制DNA的限制图谱。 Bal31与限制性内切酶协同作用可绘制物 理图谱.还可逐步缩短D