聚糖的化学市公开课获奖课件

1、高级生物化学第一章 聚糖化学 朱永宁编辑第1页第1页本章目录1.1 糖生物学1.2 寡糖研究1.3 多糖研究1.3.1 均一多糖1.3.2 不均一多糖1.4 复合多糖1.5 多糖分离纯化1.6 多糖含量测定高级生物化学第2页第2页糖知识回想糖类物质多羟基醛或酮化合物、聚合物或衍生物。依据分子大小分类单糖、寡糖、多糖；依据构成份类均一多糖、杂多糖、 糖蛋白、糖脂等。高级生物化学第3页第3页1.1 糖生物学1988年，牛津大学生化系德韦克在生化年评上,提出了“糖生物学”(Glycobiology)概念,并发表了题为糖生物学综述。高级生物化学第4页第4页糖链多样性和复杂性4 种核苷酸每3个一组，可构

2、成： 43 = 64 个三联体密码而4种己糖则可构成：3万各种寡糖链。 因此，糖链结构含有极端复杂特性糖链信息量大：糖链所包括信息量远远不小于核酸和蛋白质（甚至大几种数量级） 高级生物化学第5页第5页活性多聚糖：如：血管内皮细胞白细胞黏附分子（E-选择蛋白），能辨认白细胞表面SLex抗原(四聚糖表面抗原）。当组织受损或感染时，白细胞通过其表面SLex抗原黏附于血管内皮细胞表面白细胞黏附分子上进入受损组织，进而杀灭入侵病原体。但过多白细胞汇集，会引起炎症及类风湿等本身免疫性疾病。高级生物化学第6页第6页美籍华裔科学家王启辉首先用酶法合成了SLex（4聚糖表面抗原)；之前推算价格：20亿美元/公斤

3、。经他合成后，价格减少了34个数量级，并已由凯特尔(Cytel)公司生产。此后，格力斯迈德(Glycomed)公司从甘草中，发觉了SLex类似物-甘草素，可辨认E-选择蛋白，因此封闭血管内皮细胞表面E-选择蛋白，因而可克制白细胞汇集，从而达到抗炎目的。高级生物化学第7页第7页1.1.1 多糖 (polysaccharides,PS)多聚糖广泛地存在于动物、高等植物、微生物(细菌和真菌)及海藻等机体中。 多糖生物活性、功效及特点： 复杂、多样比如： 广谱免疫增进剂，含有免疫调整功效 如：可治疗风湿病、病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病；能抗爱滋病病毒；含有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂等疗效

4、；高级生物化学第8页第8页 增进核酸与蛋白质生物合成 可控制细胞分裂和分化，调整细胞生长与衰老； 毒性较低我国对多糖活性功效研究起步较晚，但近十几年来取得了较大进展，有大量活性多糖被发觉，并证实均含有广泛生物功效。高级生物化学第9页第9页研究发觉： 多糖活性与其结构密切相关相关原因：与单糖种类、糖苷键类型相关；与多糖取代基，尤其是硫酸基取代度与取代位置相关；与多糖空间结构相关；与多糖分子量大小相关；高级生物化学第10页第10页多糖缺点： 分子量大，粘度大，溶解扩散困难，结构复杂，因此，吸取困难，应用受限。 寡糖长处： 分子量小，结构简朴，溶解性增强，低毒性，因此，稳定性和安全性较好。 许多多糖

5、链经断裂后，可使活性提升，寡糖低毒性是多糖与其它天然活性物质所不能比拟，因此，对寡糖研究日益受到注重。高级生物化学第11页第11页对海洋生物活性物质开发利用，是近30年发展起来。海洋独特环境造就了众多含有特异性功效活性物质。多糖在其中占有主要地位。海藻多糖由于其在海藻中含量高，原料起源丰富且有保障，药理作用明显，毒副作用小，成为当前海洋药物开发热点。通过对海藻多糖结构及生物活性研究，当前已开发出各种多糖类药物。高级生物化学第12页第12页1.2 寡 糖寡糖(oligosaccharide)由2-20个单糖分子通过糖苷键连接而成化合物，它广泛存在于生命体内；主要以糖蛋白、糖脂和糖肽等糖化合物形式

6、参与生命活动；发挥生物学功效多为寡糖残基。高级生物化学第13页第13页功效性低聚糖低聚果糖、低聚水苏糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖等。功效性低聚糖吸取：人体肠胃道不含水解一些低聚糖酶系统，故不能被消化吸取；直接进入大肠被双歧杆菌利用，是肠道有益菌增殖因子，因此这些功效性低聚糖又被称为益生元。第14页第14页现已发觉在激素、抗体、维生素、生长素和其它各种生物大分子中都有寡糖存在。寡糖也存在于细胞膜表面，整个细胞膜表面都覆盖有寡糖。寡糖在生物大分子及细胞间互相作用中发挥着信号功效，桥梁作用。高级生物化学第15页第15页 寡糖分类和结构类型寡糖种类繁多，构成寡糖单糖在自然界分布广；意义较大是

7、五碳糖和六碳糖，尤其以六种单糖构成为多：葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、木糖(xylose)、阿拉伯糖(arabinose)和甘露糖(mannose)。高级生物化学第16页第16页依据构成寡糖单糖种类可将寡糖分为同源寡糖(均一)，即由同一个单糖重复成苷结合而成寡糖；异源寡糖(不均一)，即由两种或两种以上单糖构成寡糖及其衍生物；寡糖侧链化学修饰包括：胺基化、羧基化、磺酸化、磷酸化等。高级生物化学第17页第17页 寡糖生物学活性与多糖相比，因为寡糖分子量较小，结构简朴，溶解性较强，稳定性和安全性都远高于多糖；同时许多多糖链在经过不同形式断裂后，使原

8、有生物活性大大提升，有些甚至产生了特殊活性，同时寡糖还含有低毒特性，因此当前对寡糖活性研究极为重视。高级生物化学第18页第18页寡糖是生物体内主要信息物质，参与细胞接触与辨认。如：在细胞表面、细胞之间通讯，辨认和互相作用；在胚胎发育，细胞代谢，信号传递，细胞运动与黏附，以及病原与宿主细胞互相作用等方面起着主要作用。高级生物化学第19页第19页有些寡糖能激活植物自我防卫系统。有些寡糖能诱导根瘤菌固氮作用。有些寡糖可与入侵微生物上糖蛋白相结合，从而制止这些微生物对人体正常细胞侵袭。有些寡糖含有抗菌、抗病毒及提升免疫活性功效。一些寡糖含有肝素凝血功效。研究表明：血型决定族寡糖很有希望成为防治癌症药物

9、。高级生物化学第20页第20页寡糖含有营养保健功效 由于人体不具备分解、消化寡糖酶系统，在摄入之后，它很少或主线不产生热量，可有效地防治肥胖病、高血压、糖尿病等。纯寡糖如：乳果糖、果聚糖、大豆低聚糖、异麦芽糖等可造成双歧杆菌生长因子；寡糖被双歧杆菌发酵脂肪酸肠道内pH值下降有害菌群调整微生物群落合理分布B族维生素、增进肠蠕动、蛋白质吸取加快提升免疫力。高级生物化学第21页第21页寡糖研究现实状况寡糖原料难得、制取困难， 比如：一些糖蛋白、糖脂上寡糖链许多高活性寡糖还处于试验阶段， 制备办法：合成或降解为主分离检测技术尚不完善因此，寡糖研究缓慢第22页第22页 海洋寡糖生物活性海洋寡糖起源于海洋

10、生物寡糖类代表物质：几丁寡糖、褐藻寡糖、卡拉胶和琼胶寡糖等。起源丰富，结构独特，结构与内源性寡糖有诸多相同点，因此含有巨大实用性和开发潜力。高级生物化学第23页第23页卡拉胶寡糖抗肿瘤活性：对小鼠S180肉瘤含有克制作用；增进超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性，含有抗氧化功效。增进效果 硫酸取代低硫酸取代高推测抗肿瘤活性主要起源于抗氧化活性、免疫调整功效。高级生物化学第24页第24页 寡糖生物活性作用机理寡糖类生物活性通常是建立在细胞水平，主要作为调控因子或信号传导因子。当前对寡糖在细胞表面受体功效区域及准拟定位功效有了较进一步理解，这为发展新一代寡糖药物奠定了理论基础。寡糖类

11、药物主要涉及：分子间互相作用与契合，因此对其结构要求非常严格。特点：专一性高、效力高、副作用低和抗药性低等长处。高级生物化学第25页第25页糖类化合物化学修饰及其对生物活性影响许多糖类化合物本身含有抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性，但由于毒副作用较大，限制了其作为药物应用。进行化学修饰可起到下列作用：提升生物活性，减少毒副作用，通过抗病毒、参与细胞间信号传导、克制干扰或阻断病毒复制、克制酶活性等路径发挥药效。因此化学修饰被高度注重。高级生物化学第26页第26页卡拉胶及其分解寡糖卡拉胶是由一些红藻细胞壁中提取一个多糖(属于细胞壁多糖)；我国早期称其为咖啦胶、角叉莱胶、麝角菜胶等，后统称为卡拉胶。第27页

12、第27页卡拉胶：一个硫酸半乳聚糖卡拉胶结构特点：1,3-D半乳糖和1,4-D半乳糖交替连接形成骨架结构。依据半乳糖中是否含有内醚以及半乳糖上硫酸基数量和连接位置不同区分为-、-、-、-、-、-、-七种类型。常见卡拉胶多为-、-、-型高级生物化学第28页第28页高级生物化学1,3-D-半乳糖1,4-D-半乳糖内醚第29页第29页高级生物化学内醚内醚第30页第30页卡拉胶基本性质理化性质、构成与结构：溶于热水，不溶于有机溶剂；凝胶强度和粘度：受分子量、离子强度、盐、氧化剂及其它化学物质影响。卡拉胶(凝胶和非凝胶)与蛋白质反应：通过硫酸基与离子型蛋白质分子发生离子反应。反应依赖于蛋白质等电点、环境p

13、H值、卡拉胶与蛋白质比率等。高级生物化学第31页第31页卡拉胶应用卡拉胶性能优良，含有极好凝胶特性和流变特性，能与其它食品胶共溶并有协同增效作用，因此，在食品、医药、日化及其它科研领域有着极为主要应用。最主要是食品添加剂(如凝固剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂等)，广泛应用于果冻、饮料、乳制品、肉制品等食品工业。高级生物化学第32页第32页卡拉胶生物学活性卡拉胶是一个有效体内致炎剂，广泛用于各种抗炎剂检查。卡拉胶有较强抗病毒活性。是有效抗胃蛋白酶、抗溃疡、抗凝、抗栓物质；含有：克制胃蛋白酶活性、保护组织、克制溃疡、抗凝血、清除血脂等功效。高级生物化学第33页第33页硒化卡拉胶生物活性保护心脏

14、；抗氧化；免疫调整；降血糖；抗肿瘤；安全性好高级生物化学第34页第34页海藻多糖研究与进展五年前，海藻产业经济低下，出现了自二十世纪六十年代以来最低潮，但近几年来又有了大幅度提升。第35页第35页前后，支撑海藻产业褐藻胶、琼胶、卡拉胶及甘露醇价格连续下跌。比如：卡拉胶，从上个世纪八十年代中期23万元吨下降到当初34千元吨。原因：海藻产品应用面窄，是限制我国海藻工业快速发展直接原因。因此，拓宽海藻产品用途，用高新技术改造老式海藻化工产业，已成为我国当初必须面正确问题，卡拉胶高附加值化就是其主要研究议题之一。高级生物化学第36页第36页未降解卡拉胶不足分子大，粘度大，扩散困难，吸取困难；毒性大，未

15、等达到有效剂量就将试验动物致死。因此，大大地限制了其应用。因此，对海藻多糖设计改性，降解、修饰和结构衍变等研究，是取得有主要开发价值海洋功效食品、保健品和海洋新药、增长产品技术含量，增进海藻化学工业蓬勃发展必由之路。近几年来在此思想指导下使卡拉胶改造研究取得了极大进展。使得今天卡拉胶功效和活性、利用价值有了大大提升，其价格也已达到了19.5万/吨。高级生物化学第37页第37页 大豆低聚糖大豆低聚糖主要分布于大豆胚轴中,主要成份：水苏糖、棉子糖。大豆水苏糖和棉子糖属于贮藏性糖类,在未成熟豆中几乎没有,随种子成熟含量递增。但当大豆发芽、发酵或者大豆贮藏温度低于15、60%相对湿度条件下,水苏糖、棉

16、子糖含量也会减少。高级生物化学第38页第38页棉子糖分子式-D-呋喃(型)果糖基-O-D-吡喃半乳糖基-(16)-D-吡喃葡糖苷高级生物化学-D-果糖（12）-,-D-半乳糖(16)-, -D-葡糖 1612第39页第39页水苏糖分子式高级生物化学-1,6-1,6,-1,2166112第40页第40页大豆及大豆制品中水苏糖、棉子糖含量(%)高级生物化学第41页第41页大豆低聚糖理化特点 有甜味：甜度=70%蔗糖； 产热低：2千卡/克, 热值=50%蔗糖能够替换蔗糖作为低热能甜味剂 无色透明液体， 粘度：麦芽糖大豆低聚糖异构化糖 保温、吸湿性：小于蔗糖，优于果糖和葡萄糖 水分活性：靠近蔗糖可用于

17、清凉饮料和焙烤食品；可减少水分活性，克制微生物繁殖；可起到保鲜、保湿效果高级生物化学第42页第42页 酸性热稳定性强，不小于果糖低聚糖和蔗糖140时开始热分解适合用于需要加热杀菌酸性食品。90，pH3.5,30min低聚糖受热后残余率：大豆低聚糖：90%蔗糖：70%80%;果糖低聚糖：40%45%。 大豆低聚糖属非还原糖，在食品加工中添加,可减少美拉反应，减少营养素损失，并且使用以便。高级生物化学第43页第43页 含有明显克制淀粉老化作用如在面包等面类食品中添加大豆低聚糖,能延缓淀粉老化，预防产品变硬，延长货架期:第44页第44页大豆低聚糖生理功效 难消化水苏糖、棉子糖不会被人体消化酶分解，也

18、不会被小肠消化吸取当到达消化道下部时，可被肠内双歧杆菌利用。第45页第45页 双歧杆菌对大豆低聚糖选择利用率精制大豆低聚糖： 水苏糖71%、棉子糖20%、其它成份2%。因此，大豆低聚糖主要成份水苏糖、棉子糖，两者尤其容易被双歧杆菌利用，难被肠内有害菌利用（肠内有害菌荚膜梭菌，大肠杆菌几乎不利用）。第46页第46页 增殖双歧杆菌、改进肠内菌丝人们食用大豆低聚糖及加入双歧杆菌食品时，会对肠内菌丝产生良好影响。 克制肠内腐败物生成克制肠道氨生成克制有害物质，增进一些酶活性如：可使-葡萄糖醛酸苷酶、偶氮还原酶、致癌物质生成酶活性下降。第47页第47页 改进排泄功效大豆低聚糖不能被人体直接消化、吸取。到

19、达回肠时，就成为双歧杆菌“食饵”。增进肠道内有益细菌活化、增殖，可增进肠道健康，产生“整肠功效”。低聚糖肠内有益细菌(双岐杆菌)增殖整肠作用改进便秘净化肠道第48页第48页 安全性和保健性急性、亚急性毒性试验、诱变性试验证实：大豆低聚糖不存在安全问题以腹泻为指标，大豆低聚糖最大作用量0.64克/kg体重（32g/50kg）含有减少血液胆固醇、降血压、增强免疫功效，含有防癌、抗衰老作用，不引起龋齿等保健功效。第49页第49页大豆及大豆制品中水苏糖、棉子糖含量(%)高级生物化学第50页第50页1.3 多糖研究多糖又称多聚糖(polysaccharide) 单糖聚合而成，聚合度大于20极性复杂大分子

20、，分子量为数万数百万。高等动植物细胞膜和微生物细胞壁天然高分子含碳化合物，它是生命活动4大基本物质之一。按其起源不同，可分为5大类：真菌多糖、高等植物多糖、藻类地衣多糖、动物多糖、细菌多糖。当前已发觉活性多糖有几百种。高级生物化学第51页第51页研究表明：多糖含有各种生物活性，这对维持生物机能密切相关。多糖可与蛋白质、脂类形成糖蛋白和脂多糖。在细胞辨认、分泌以及在蛋白质加工和转移方面起着不容忽略作用。自20世纪50年代末人们发觉真菌多糖含有抗肿瘤活性，此后，多糖研究越来越受到注重。高级生物化学第52页第52页1.3.1 均一多糖由一个单糖缩合而成多糖均一多糖，如：戊糖胶，木糖胶, 阿拉伯糖胶、

21、己糖胶(淀粉、糖原、纤维素等)。多糖在水溶液中不形成真溶液，只能形成胶体溶液，甜味很淡，无还原性，有旋光性，但无变旋现象。高级生物化学第53页第53页几种常见均一多糖 淀粉（直链淀粉、支链淀粉） 糖原 纤维素上列都是由葡萄糖经过不同糖苷键连接而成多糖。高级生物化学第54页第54页几丁质(chitin)几丁质也称壳聚糖，大量存在于昆虫和甲壳类动物甲壳之中。因此，几丁质又被称为甲壳素。虾、蟹壳中富含甲壳素为白色、无定形半透明物质。据报道，自然界中每年生成几丁质约有一百亿吨。在天然多糖中几丁质贮存量占第二位，仅次于纤维素。 高级生物化学第55页第55页几丁质结构几丁质是由乙酰氨基葡萄糖聚合而成均一多

22、糖。也称聚乙酰氨基葡糖(或壳多糖)。在提纯和水解几丁质时可得到寡糖成份，如：2-乙酰氨基-2-脱氧基-D-吡喃葡糖同聚物；是-l,4-糖苷键连接成无分支长链结构。几丁质也可视为纤维素类似物。相称于葡糖C-2位上-OH由CH3-CO-NH-取代。几丁质难以单独存在于自然界，普通以与蛋白质络合或共价结合形式存在。 高级生物化学第56页第56页几丁质结构和构象高级生物化学-1,4第57页第57页几丁寡糖生理功效a. 植物调整功效几丁质酶诱导产生自我防御激活剂：在几丁质酶作用下，几丁质降解寡聚糖片段诱导植物防御素分泌自我防御功效；高几丁寡糖功效：阻碍病原菌生长繁殖几丁寡糖功效：调整植物基因关闭与开放，

23、增进植物细胞活化，提升防御功效,刺激植物生长。高级生物化学第58页第58页b. 几丁寡糖有增进双歧杆菌生长功效双歧杆菌促生长因子之一；调整动物肠道微生物代谢活动，改进微生物分布；增进双歧杆菌生长繁殖，提升机体免疫力，使肠道内pH下降；克制肠道有害菌生长，产生B族维生素；分解致癌物，增进肠蠕动，增进蛋白质吸取。高级生物化学第59页第59页c. 提升机体免疫力几丁寡糖抗感染作用机理：某刺激机体腹膜渗出液细胞增长激活巨噬细胞增长活性氧生成氧化性杀菌机制增强抗感染作用增长；对巨噬细胞激活可产生下列作用:激活T淋巴细胞杀伤活性增强； 原因:释放巨噬细胞激活因子（MAF） 激活巨噬细胞因此认为：几丁寡糖杀

24、伤活性产生主要是激活T淋巴细胞与巨噬细胞，且使其互相加强所至。高级生物化学第60页第60页d.应用进展与市场前景几丁寡糖在精细化工领域应用广泛：有良好保湿增湿作用，克制皮肤表面细菌活化，可应用于美容、化妆、抗衰老等精细化工研究领域。是一个性能优秀日化原料，市场前景辽阔。高级生物化学第61页第61页几丁寡糖在生物医药领域应用制备抗癌药物尤其是68糖低聚体，可通过活化人体淋巴细胞达到克制癌细胞繁殖和扩散达到抗癌作用。癌细胞形成伴随大量癌毒素释放人体中铁质贫血、食欲减退，几丁寡糖：在人肠内可形成小分子基团易被吸取， 克制癌毒素在体内释放。几丁寡糖：一个良好聚电解质可吸附在血管 内皮细胞表面克制癌细胞

25、转移。高级生物化学第62页第62页甲壳质和壳聚糖在调血脂、降胆固醇方面有功效；这些多糖无毒、不产生变态反应，对机体含有温和免疫刺激作用，使其在调血脂、降胆固醇药物方面含有优势。浙江省温岭市已用壳聚糖系列产品开发了康达舒降血脂片。高级生物化学据报道：第63页第63页保健食品领域几丁寡糖作为自然界中一个碱性多糖，生物活性高，无毒、无副作用，可被机体快速吸取。以几丁寡糖为主要原料生产保健食品能够提升机体免疫力，活化细胞，增进肠道双歧杆菌等有益菌增生，并克制有毒菌生成。当前几丁寡糖主要消费地在日、韩、美、法、俄等国家。高级生物化学第64页第64页我国科技部在“十五”攻关计划中将“壳寡糖新产品开发应用”

26、 列为主要项目。要求建立数条年产500吨以上壳寡糖生产线，以满足国内市场需求。壳寡糖作为一个含有一定前瞻性医药新产品，国内外市场前景辽阔。高级生物化学第65页第65页农林畜牧领域壳寡糖含有良好抗病虫害功效，并且含有安全、微量、高效、成本低等长处。壳寡糖是生物杀虫剂良好原料。高级生物化学第66页第66页展望开发应用壳寡糖是甲壳质行业必定方向，也是当今生物制药技术一个亮点。当前壳寡糖产品年需求量在6000吨以上，其科研开发主要集中在日本、韩国等国家。20世纪90年代末，酶法生产壳寡糖在日本、韩国实现了产业化。我国对该产品研究起步较晚，近年来趋于活跃，作了大量工作。8月，山东济南海得贝公司利用复合酶

27、法制备壳寡糖生产线正式投产，预示着在我国也第一次实现了壳寡糖产业化生产。高级生物化学第67页第67页 真菌多糖是由真菌实体和菌丝体所产生一类代谢产物。当前，在全球范围内约有数千种真菌。其中不但有许多有实用价值美味真菌，也有许多含有保健功效真菌。当然也有一些有毒性真菌。活性真菌多糖：分为纯多糖和杂多糖两类纯多糖：20个以上单糖通过糖苷键连接而成，可分为直链和支链结构。杂多糖（复合多糖)：由糖链和肽链或脂类构成。当前己开发活性多糖：灵芝多糖，香菇多糖，猴头菇多糖，茯苓多糖，银耳多糖等。高级生物化学第68页第68页活性真菌多糖主要功效：刺激免疫活性，增强网状内皮系统吞噬肿瘤细胞作用，增进淋巴细胞转化

28、，激活T细胞和B细胞，增进抗体形成。含有抗肿瘤活性。但对于肿瘤细胞并无直接杀伤作用。能减少甲基胆蒽诱发肿瘤发生率，对一些易发生转移，不易采用手术治疗肿瘤，如：白血病，淋巴瘤等，有特殊功效。高级生物化学第69页第69页1.3.2 不均一多糖糖胺聚糖，又称为糖胺多糖、粘多糖、氨基多糖、酸性糖胺聚糖等。糖胺聚糖可通过共价键与蛋白质相连接构成蛋白聚糖。存在于软骨、管腔等结缔组织中，构成组织间质。如：各种腺体分泌润滑粘液等。高级生物化学第70页第70页糖胺聚糖在组织生长、再生、受精过程中、在机体与各种传染病原体(细菌、病毒)互相作用过程中都起着主要作用。 代表物质如：透明质酸、软骨素4-或6-硫酸、硫酸

29、皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素等。高级生物化学第71页第71页细菌细胞壁多糖高级生物化学肽聚糖（细胞壁）（脂双层膜）（四肽）（肽聚糖结构）（革兰氏阳性菌）磷脂酸多聚糖表层第72页第72页细菌细胞壁多糖（外脂膜）（脂蛋白）（肽聚糖）（四肽在3-4间交联）（脂双层膜）（革兰氏阴性菌）(细胞壁)（脂多糖）（细胞周质间隙）高级生物化学第73页第73页高级生物化学(肽链）(N-乙酰氨基葡萄糖，NAG）(N-乙酰胞壁酸，NAM）(五甘氨酸桥）肽聚糖第74页第74页粘多糖结构（硫酸软骨素）（硫酸角质素）（透明质酸）GalNAc-6s：N-乙酰半乳糖- 6磺酸 高级生物化学GlcUA：葡糖酸Gal：半

30、乳糖GLcNAc：N-乙酰葡糖胺第75页第75页细胞壁多糖与蛋白连接（中心蛋白）（硫酸角质素）（硫酸软骨素）（透明质酸）（链接蛋白）高级生物化学第76页第76页高级生物化学（硫酸软骨素）（透明质酸分子）（关键聚蛋白）（N-末端透明质酸黏合区域）（硫酸角质素）(结合糖)(结合蛋白)第77页第77页透明质酸(hyaluronic acid)透明质酸是糖胺聚糖中结构最简朴一个，它结构中含有重复二糖结构单位：（D-葡糖酸）（N-乙酰葡糖胺）透明质酸盐（酯）高级生物化学第78页第78页透明质酸功效同时存在于高等动物组织中和一些细菌中，如A型链球菌等。功效：在组织中吸附水分，起润滑剂作用。广泛分布于哺乳动

31、物体内，尤其是润滑液、玻璃样体液中，另外关节液、疏松结缔组织、脐带、皮肤、动脉管壁、心脏瓣膜、角膜以及雄鸡冠中也较多。高级生物化学第79页第79页硫酸软骨素4（或6）分为：软骨素-4-磺酸软骨素-6-磺酸二者间除黄酸基位置不同，红外光谱差异较显著外，其余理、化性质均较靠近。磺酸软骨素含有重复二糖单位，其结构如右图： N-乙酰半乳糖胺D-葡糖酸高级生物化学第80页第80页最初从猪皮中分离，后发觉存在于许多动物组织，如猪胃粘膜、脐带、肌腱、脾、脑、心瓣膜、巩膜、肠粘膜、关节囊、纤维性软骨等组织中。结构与性质都与硫酸软骨素相同，其二糖结构如图： （L-葡糖醛酸）（N-乙酰-D-半乳糖胺）（硫酸皮肤素

32、）高级生物化学硫酸皮肤素第81页第81页硫酸角质素首先从角膜蛋白水解液中分离得到，后证实在人积极脉和人、牛髓核中也存在。婴儿几乎不含硫酸角质素，伴随年龄增大产生并逐步增长，直到20-30岁时，它含量约占肋软骨中粘多糖总量50%。高级生物化学重复二糖单位第82页第82页肝 素肝中肝素含量最丰富。 但也广泛分布于哺乳 动物组织和体液中。 猪胃粘膜中含量十分丰富，肺、脾、肌肉和动脉壁肥大细胞中含量也很高。生物学意义：抗血液凝固当前输血时，多以肝素为抗凝剂，临床上用于预防血栓形成。（D-葡糖醛酸）（N-乙酰-或N-磺酰-D-葡萄糖胺）高级生物化学重复二糖单位第83页第83页1.4 复合糖多糖与非糖物质

33、如脂或蛋白质共价结合，分别形成脂多糖、糖脂、糖蛋白和蛋白聚糖，统称为复合糖。复合糖普遍存在生物界，在体内含有各种生物活性功效。高级生物化学第84页第84页1.4.1 脂多糖脂多糖种类繁多，革兰氏阴性细胞壁含有非常复杂脂多糖。分子结构多由三部分构成，即：高级生物化学 第85页第85页中心多糖链己糖寡糖庚糖-2-酮-3-脱氧辛酸寡糖高级生物化学 第86页第86页脂多糖中脂质结构高级生物化学 第87页第87页脂多糖结构和功效关系细菌脂多糖外层寡糖链是细菌致病关键磷酸基可与其它离子结合，对维持菌体细胞壁离子环境起主要作用；外层寡糖链和中心多聚糖中一些单糖对细菌生长并不是必需。高级生物化学第88页第88

34、页1.4.2 糖蛋白及蛋白聚糖多糖以共价键形式与蛋白质连接形成生物大分子。高级生物化学第89页第89页 糖蛋白（glycoprotein） 分布于动物、植物、真菌、细菌及病毒体内复合糖。几乎所有细胞均可合成。糖蛋白短链寡糖与蛋白质共价结合，以蛋白质为主，是含糖量改变较大一类复合糖。如： 胶原蛋白含糖量：1% 可溶性血型物含糖量： 85% 多数含糖量较低糖蛋白中糖多为半乳糖或甘露糖衍生物， 如：N-乙酰氨基多糖等；高级生物化学第90页第90页连接方式糖肽键寡糖与多肽(蛋白质)中氨基酸以共价连接，构成糖肽连接键，简称糖肽键，其类型可概括下列： 1以ser、Thr、Hyp、Hyl-OH为连接点， 形

35、成-0-型糖肽键； 2以Asn-CO-NH2、N-末端氨基酸-HN2以及Lys或ArgR-NH2为连接点，形成-N-型糖肽键； 3以Asp或Glu游离-COOH为连接点， 形成-CO-O-型糖肽键型； 4以Cy-SH为连接点， 形成-S-型糖肽键。 高级生物化学第91页第91页糖蛋白功效糖蛋白可被分泌进入体液或作为膜蛋白。许多酶类、蛋白质类激素、血浆蛋白、所有抗体、补体因子、血型物质和粘液组分以及许多膜蛋白均属糖蛋白。高级生物化学第92页第92页蛋白聚糖(proteoglycan)由蛋白质与糖胺聚糖共价连接而成。其中糖胺聚糖含量高，链长并且无分支，并含有二糖重复单位，含较多酸性基团（羧基、磺酸

36、基等），是负性较强大分子，如：透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素等均属这类。蛋白聚糖功效与糖胺聚糖酸性基团密切相关。高级生物化学第93页第93页糖胺聚糖与蛋白质连接三种方式：D-木糖与Ser-OH之间-O-糖苷键N-乙酰半乳糖与Thr、Ser间形成-O-糖苷键N-乙酰葡糖胺与Asn形成-N-糖苷键蛋白质居中间，构成关键蛋白。糖胺聚糖分子排列在蛋白质两侧，称为蛋白聚糖“单体” 高级生物化学第94页第94页（蛋白聚糖混合物）（FGF受体）（细胞外侧）（细胞质）（硫酸肝素）多配体(蛋白)聚糖FGF:成纤维细胞生长因子高级生物化学第95页第95页连接方式和多样性（N-乙酰半乳糖胺）（N-乙酰葡萄糖

37、胺）高级生物化学(Asn)(Thr)第96页第96页膜蛋白中糖（磷脂）（膜内在蛋白）（糖脂）（寡糖）（膜内在蛋白）（胆固醇）（疏水螺旋）高级生物化学第97页第97页膜蛋白分子中糖（低聚糖）（胞内）（脂双层）（胞外）高级生物化学第98页第98页糖蛋白分子中多糖高级生物化学（透明质酸）（N-链接低聚糖）（O-链接低聚糖）关键蛋白第99页第99页糖蛋白分子中多糖（硫酸角质素）（硫酸软骨素）高级生物化学第100页第100页第101页第101页1.5 多糖分离纯化多糖是极性大分子化合物，多易溶于水，不溶于乙醇。惯用水、稀碱溶液抽提，氯化钠梯度洗脱。超声处理可加速多糖释放注意：在较强碱性溶液中多糖可被水解

38、 高级生物化学第102页第102页 动物多糖提取动物多糖特点： 显酸性，存在结缔组织中，多与蛋白质结合惯用三种分离办法： 碱溶液提取法； 中性盐溶液提取法； 蛋白酶消化法。蛋白酶消化法为最佳，降解少，产量高。比如：鹿茸中酸性多糖提取木瓜酶消化 鹿茸渣+木瓜酶+酶活化剂60水浴消化24h 上清液(沉淀可重复处理)加醇将多糖沉淀析出高级生物化学第103页第103页植物多糖提取植物根、茎、叶、花、果、种子中存在大量多糖。植物多糖多不溶于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇沉淀被分离。单一植物多糖分离提取极为困难。对含脂较高根、茎、叶、花、果及种子等，应先脱脂，再水提。对含色素较高样品，需先脱色处理。高级生

39、物化学第104页第104页分离植物单一多糖普通流程用水或甲醇等有机溶剂浸泡（浸提）；低温减压（浓缩）；流水透析（除小分子）；凝胶柱层析（分离纯化）；冷冻干燥(得较单一多糖)；高效液相色谱或凝胶层析（测定其纯度、分子量）；酸解气-液相层析或纸层析（测定其单糖构成） 如人参多糖(panaxans)，苍术多糖(atractans)， 乌头多糖(aconitans)，栝萎根多糖(trichosans)， 紫草多糖(lithospermans)等提取均可用上列办法。高级生物化学第105页第105页 菌类多糖提取除去小分子杂质透析法(用不同型号透析膜)。除去游离蛋白质由Sevag法，三氟三氯乙烷法和三氯醋

40、酸法。三者均为沉出法。 注：前两种方法惯用于微生物，后者多用于植物。它们均不适于糖蛋白，因为，可将糖同时沉除。 糖蛋白质中蛋白质去除：蛋白酶破坏蛋白质与糖结合，再除蛋白质。高级生物化学第106页第106页a. Sevage 法：依据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性特点：样品中加入：氯仿:戊醇(或正丁醇)5:1 (或4:1)混合物猛烈振摇2030min（蛋白质与混合物生成变性凝胶状而被分离）离心 除去变性蛋白质（水层和溶剂层分界处）长处：克制降解，如配合蛋白质水解酶效果更佳。 高级生物化学第107页第107页胰蛋白酶-Sevage法联用脱除柿多糖蛋白由正交试验找出酶法脱蛋白最优条件，比较酶法、Sev

41、age法、酶-Sevage联使用办法脱蛋白效果和多糖保留率。试验工艺：胰酶液(1mg/ml)和粗多糖液(50mg/ml) 以0.41，37 5h，加0.2倍体积pH7.010%H2O2，过夜；再加1/3 体积氯仿-正丁醇(Sevage)，充足混合20min，4000r/min 离心5min，重复3次,至两相界面无蛋白沉淀，透析24h，得水提多糖精品，4保留。此时，蛋白质含量为0.368mg/ml，多糖含量为86.9%，蛋白脱除率为83.8%。结论：酶-Sevage联使用办法对蛋白脱除率和多糖保留率均较高，工艺简朴，适宜于脱除柿多糖蛋白。高级生物化学案 例第108页第108页猴头多糖脱蛋白办法研

42、究Sevage法脱蛋白配制1%猴头粗多糖溶液, 加入1/ 4 体积Sevage试剂(V氯仿V正丁醇= 41)振摇20min 静置30min 离心除去沉淀。测定上清液中多糖和蛋白质含量。上清液重复以上脱蛋白环节，直至离心无沉淀产生.高级生物化学第109页第109页 三氯醋酸法脱蛋白(TCA)配制1%猴头粗多糖溶液加入TCA 振摇20 min 静置30 min 离心除去沉淀，测定上清液中多糖和蛋白质含量。最佳TCA 用量选择：试验中摸索TCA 用量(对糖液质量比) 分别为 0. 1%、0. 5%、1%、2. 5%、5% ,做单因子试验，找到除蛋白后含糖量最高、含蛋白量最低配比。高级生物化学第110

43、页第110页b. 三氟三氯乙烷法：多糖溶液:F3C-CCl3=1:1混合低温搅拌10min离心取上层水层（多糖层），弃沉淀。水层继续用上述办法处理几次，即得无蛋白多糖溶液。特点：效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量使用。以上办法均不适合糖蛋白。高级生物化学第111页第111页c. 三氯醋酸法（TCA）：多糖水溶液滴加5-30%三氯醋酸直至不再继续混浊在510放置过夜离心弃沉淀无蛋白质多糖溶液。缺点：引起一些多糖降解不适合糖蛋白。高级生物化学第112页第112页d.糖蛋白蛋白分离对碱稳定糖蛋白在硼氢化钾（KHB3）存在下用稀碱温和处理糖与蛋白质结合点打开将蛋白质沉淀离心弃去得到多糖溶液。高级

44、生物化学第113页第113页多糖纯化 沉淀法分部沉淀法、盐析沉淀法、金属络合物沉淀法和季铵盐沉淀法等。安络小皮伞粗多糖纯化： 小皮伞粗多糖水溶液 + 斐林试剂 调溶液达到不同乙醇浓度得各种多糖（乙醇分级分离） 高级生物化学斐林试剂：碱性硫酸铜（配备成甲、乙液。用时按要求混合。第114页第114页醇沉流程： 多糖水溶液浓缩加入95%乙醇醇沉（醇终浓度依多糖结构和性质，在70%-85%范围内） 静置24h分离沉淀弃小分子杂质弃蛋白质脱色再醇沉 沉淀分别用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤60减压干燥。高级生物化学第115页第115页凝胶柱色谱法选琼脂糖凝胶(Sepharose)作吸附剂，以不同浓度盐溶

45、液和缓冲液作洗脱剂，使各种多糖得以分离纯化。日本学者用Sepharose-6B、Sephacryl S-200和S-500等色谱柱对人参粗多糖进行重复分离纯化，并经透析和Sephadex-G10 处理，最终分出21种均一性多糖。但此方法不宜粘多糖分离。高级生物化学第116页第116页阴离子互换树脂层析法最常见：互换剂DEAE-纤维素(阴离子互换树脂，硼酸型或碱型)；洗脱剂：可用不同浓度碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。当前此法惯用于纯化多糖。还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。高级生物化学第117页第117页太子参多糖分离：粗多糖加水溶解透析DEAE-纤维素柱层析，以02mol/L NaCl 水溶液梯度洗脱SephadexG-100柱层析精制得两种均一多糖。另外：超滤法、制备性区域电泳法、活性碳柱层析等也可起到一定分离作用。高级生物化学第118页第118页1.6 多糖纯度分析纯度判断基本原则： 糖基摩尔比恒定； 电泳呈一条带； 柱层析呈一个峰。高级生物化学第119页第119页电泳法：醋纤膜电泳；玻璃纤维纸电泳；PAG电泳；琼脂糖凝胶电泳等。中性糖导电弱、分子量大、在电场中移动慢，故常需加高电压、pH9-12硼酸缓冲液， (糖类易与硼酸离子结合形成配合物，从而增长导电性)可用阿利新蓝、甲苯胺蓝、P-茴香胺硫