生物样品的常用分析方法课件

1、 体内药分专题之五 生物样品常见分析方法思考 1.在体内药物分析中所采用的生物 样品有哪些? 2.最常用的生物样品是什么?3.药物分析中常见分析方法包括哪些?哪些适用于体内药物分析? 生物样品的常用分析方法 体内药物分析是借助于现代化的仪器与技术来分析药物在体内数量与质量的变化，以获得药物在体内的各种药代动力学参数、代谢方式、代谢途径等信息。目前，用于生物样品分析的方法有很多，归纳起来主要有以下几类： 生物样品的常用分析方法 1. 色谱分析法 2. 光谱分析法 3. 免疫分析法 4. 微生物分析法 5. 电化学分

2、析法 com色谱法(chromatography) 色谱法(chromatography) 一种物理或化学的分离分析方法，其分 离原理主要是利用物质在流动相和固定相中的分配系数，或吸附能力的差异而达到分离。 包括薄层色谱(TLC)，纸色谱(PC)，凝 胶色谱，气相色谱(GC)和液相色谱(LC)。 薄层色谱法（thin layer chromatography ） 分离速度快 优点 检出灵敏度高 选择性好 显色方便等 缺点：对生物高分子分离效果不甚理想。 薄层扫描法 (TLCS)系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄

3、层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方法。与高效液相色谱法相比，具有多通道效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。已成为薄层色谱常用的定量方法，在体内药物分析中广泛应用。 气相色谱法 (gas chromatography，GC)定义：以气体为流动相的的色谱法称为气相 色谱法。分类：按固定相的聚集状态：GSC、GLC按分离原理：GSC属于吸附色谱、GLC 属于分配色谱按色谱操作形式：填充柱气相色谱、毛

4、细管柱气相色谱。优点：1.效能高 neff可达103-106。2.灵敏度高 检测限可达纳克级或更低。3.选择性高 固定相对性质极为相似的组分，如烃类异构体等有较强的分离能力。4.分析速度快 一般的气相色谱分析一次仅需几分钟。5.应用范围广 气相色谱法广泛应用于气体和易挥发性物质或可转化为易挥发性物质的生物样品的定性和定量分析。 气相色谱法 (gas chromatography，GC) 气相色谱法 (gas chromatography，GC) 缺点：要求被测药物及其代谢物必须具有一定的 挥发性和热稳定性。解决方法

5、：固定相发展和衍生化试剂的广泛使用，使生物样品不再受限制。气相色谱法(gas chromatography ，GC)结论: 该方法简便、快速、准确，检出限低，适合中毒病人血液中溴氰菊酯含量的测定。定义 高效液相色谱法优点 以经典液相色谱为基础，以微粒型填料作固定相，采用高压送液泵和各种高灵敏度检测器。 分离效能高检测灵敏度高分析速度快 选择性好 适用范围广分离方法 高效液相色谱法高效液相色谱法 主要根据是样品的相对分子质量的大小，在水中

6、和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。色谱分离方法的选择高效液相色谱法一、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析 。 相对分子质量在2002000的化合物，可用液-固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则可用空间排阻色谱法。高效液相色谱法二、溶解度 水溶性样品最好用离子交换色谱法和液-液分配色谱法； 微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法； 油溶性样品或相对

7、非极性的混合物，可用液-固色谱法。高效液相色谱法三、化学结构 若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液-液分配色谱也都能顺利地应用于化合物；异构体的分离可用液-固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液-液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。高效液相色谱法高效液相色谱法串联紫外- 荧光检测器同时测定人血浆中对乙酰氨基酚与盐酸曲马多的浓度为10.03 ng/ml，线性范围为10.0340110 ng

8、/mL，日内RSD为1.9% 5.9% ，日间RSD为3.4% 7.3%。受试制剂中对乙酰氨基酚的相对生物利用度为(96.1 15.0) % ，曲马多的相对生物利用度为(93.9 15.3) %。结论:本方法操作简便、灵敏度高，可用于临床血药浓度测定。受试制剂与参比制剂生物等效。 胶束电动毛细管色谱(MECC) 在MECC体系中存在着以胶束形式存在的准固定相和作为载体的液体流动相，胶束带电荷在电场的作用下产生泳动，溶质中各组分依据其在水相和胶束相之间的分配差异及在电泳和电渗流驱动下出现淌度差异而分离。优点：手性拆分

9、常用的分离模式之一，只需在背景电解质中添加手性选择剂，构建手性环境，即可进行手性拆分，本法适用于拆分人体内的氨基酸。涡流色谱技术(TFC) 涡流色谱技术是利用大粒径填料使流动相在高流速下产生涡流状态，从而对生物样品进行净化与富集。优点: 可以在线处理生物样品，速度快、选择性好、灵敏度高，易于实现自动化，近年来在生物领域尤其是体内药物分析中得到了广泛的应用。参考文献：涡流色谱技术在生物样品分析中的应用刘朋，周建良，安婧婧，李萍，Chinese Journal of Chromatography1 光谱法(Spectroscopy) 光谱法是基于检测能量（电磁辐射）作用于待测物质后产生的辐射信号或

10、所引起的变化的分析方法。特点应用于体内药物分析的光谱法 比色法（COL） 紫外分光光度法（UV） 荧光分析法（Fluorescence method） 原子吸收分光光度法（AAS）一.比色法（COL）属于吸收光度法 定量依据-Lambert-Beer定律 A=ECL 物质在一定波长处的吸收度与其浓度成正比。比色法仅用于少数药物浓度高，干扰成分少的生物样品的测定。主要用于药物监测和人群代谢分型的测定，逐渐被现代色谱分析方法所取代。紫外分光

11、光度法（UV） 原理同比色法。适用于测定具有紫外吸收的药物。 体内药分中母体药物与代谢物的紫外吸收光谱非常相似，易产生干扰。受灵敏度和选择性的限制，其在体内药分中的应用也呈下降趋势。 荧光分析法（Fluorescence method） 利用物质经光照射后能发射荧光的特性进行分析的光学分析法。 优点： 1.灵敏度高。检出限可达10-10 g/ml10-12g/ml。 2.选择性好。荧光分析法（Fluorescence method）1.直接测定法 适于自身能产生荧光的物质，因荧光性质与溶液的pH有关，故荧光强度的测

12、定须在适宜的pH介质中进行。(一)常规荧光分析法2.间接测定法 将无荧光或弱荧光物质衍生化，测定衍生物荧光强度的方法。荧光分析法（Fluorescence method）利用胶束溶液对荧光物质的增溶、增敏和增稳作用，大大提高荧光分析法的灵敏度和稳定性。（二）胶束增溶增敏荧光分析法用-CD单分子胶束荧光技术检测秦艽中龙胆苦苷血药浓度。 龙胆苦苷嵌入-CD的疏水空洞中，使其在胶束中溶解度增加和相互碰撞几率减少，荧光量子效率提高，从而提高检测灵敏度。荧光分析法（Fluorescence method）（三）荧光探针分析法

13、 使用荧光探针从无荧光的药物制备有荧光的衍生物。优点1增强待分析物质的荧光响应，提高检测灵敏度和选择性。2稳定分析物，尤其针对活泼的和有挥发性的化合物。3有助于化合物基团的确证。局限 衍生化增加分析步骤，易引入分析误差。荧光分析法（Fluorescence method）示例 Tb-吡哌酸的荧光体系及尿和血清中吡哌酸含量的测定 应用镧系离子发光探针生成Tb-吡哌酸配合物，在紫外光照射下发生分子内能量传递使Tb产生特征荧光，其荧光强度与吡哌酸浓度呈线性关系，从而建立一种灵敏、快速的分析吡哌酸的方法。4荧光分析法（Fluorescence method）（四

14、）荧光淬灭分析法 待分析的物质能使某种荧光化合物的荧光淬灭，通过测量荧光化合物荧光的下降，间接测量该分析物质。原子吸收分光光度法（AAS） 原子吸收分光光度法是基于蒸汽相中被测元素的基态原子对其原子共振辐射的吸收来测定样品中该元素含量的一种方法。 原子吸收分光光度法在测定体液中微量金属元素方面占有特殊的地位。原子吸收分光光度法（AAS）优点： 灵敏度高，精密度好，选择性好，应用范围广，试样用量少，简便快速，易于自动化。局限性： 1.该法只能进行无机元素的含量分析，不能直接用于有机化合物的含量分析和结构分析；2.每测

15、一种元素要更换一次空心阴极灯，不能同时进行元素分析；3.标准工作曲线的线性范围窄，一般为一个数量级。原子吸收分光光度法（AAS）原子吸收分光光度计主要部件： 光源（空心阴极灯） 原子化器 单色器 检测系统原子吸收分光光度法（AAS）ab吸收光谱仪光源单色器样品检测器读出器件原子化器 单色器光电倍增管样品空心阴极灯读出器件原子吸收分光光度法（AAS） 直接测定法 石墨炉原子吸收法测定大鼠血清、尿、胆汁和组织中的顺铂 间接测定法 尿样中氨基多糖含量的测定 www。themegal

16、免疫分析法放射免疫分析法 (radioimmunoassay) 原理:放射性标记抗原和未标记抗原（待测物）与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。用反应式表示为： Ag + Ab=Ag-Ab + Ag* | Ag*-A放射免疫分析法 (radioimmunoassay)1灵敏度高2特异性强3取样量少，适用于大批量样品的测定优点：放射免疫分析法 (radioimmunoassay)1需要用放射性同位素标记抗原，其放射性对操

17、作人员的健康、对环境的污染都会造成危害。2有时会出现交叉反应、假阳性反应。3需要有专用的同位素实验室及免疫测定仪器。缺点：放射免疫分析法 (radioimmunoassay)应用实例最典型的例子是：地高辛的血药浓度测定酶免疫分析法 （enzyme Immunoassay）均相EIA 非均相EIA 酶免疫分析法均相EIA非均相EIA酶联免疫吸附测定（ELISA） 原理： 将特异的抗原- 抗体免疫学反

18、应和酶催化反应相结合，以酶促反应的放大作用来显示初级免疫反应。酶联免疫吸附测定（ELISA） ELISA是通过在合适的载体上，酶标限定量抗原与未知抗原竞争固相抗体结合位点或固相抗原与未知抗原竞争限定量的标记抗体结合位点，形成抗体复合物。在一定底物参与下，复合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或还原成另一种带色物质。由于酶的降解底物与显色是成正比的，通过肉眼观察或分光光度计测定，从而确定是否存在未知抗原或含量。酶联免疫吸附测定（ELISA）应用实例：酶联免疫分析法及其在食品农药残留检测中的应用武中平，徐春祥等 酶免疫分

19、析法检测肝肾胰岛细胞移植患者术后CSA浓度的临床评价 温冬梅 ，梁剑平 ，吴剑杨 ，庞嘉琳 ，李曼 酶免疫分析法（enzyme Immunoassay）酶标记物是非放射性同位素，可避免对人体的放射性伤害和对环境的污染。酶标记物比较稳定，半衰期可超过一年。反应不需温育，均相EIA不需分离直接测定。反应可用可见-紫外分光光度法测定。4123EIA优点：酶免疫分析法（enzyme Immunoassay）标记酶不能像同位素标记物和荧光标记物那样直接产生信号，须有其他试剂（酶底物、辅酶）的参与，才能完成酶反应。EIA缺点：

20、化学发光免疫分析（CLIA） 化学发光免疫分析（CLIA）是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，借以检测超微量物质的一种分析技术。化学发光免疫分析包含两个部分，即化学发光系统和免疫反应分析系统。 化学发光分析系统：经催化剂的催化和氧化剂的氧化激发 态的中间体光子发光信号光量子 产额。 免疫反应系统：类似于抗原与抗体 化学发光免疫分析（CLIA）按发光剂不同分为:1.直接化学发光物质标记法（CLIA）发光剂直接标记抗体，多用吖啶酯类和苯酚类化合物。2.化学发光酶免疫分析法（CLEIA）以催化反应的

21、酶为标记物，抗原抗体结合后，其中的酶可对发光体系产生催化作用，产生发光效应。多用的发光体系是HRP-鲁米诺。3.电化学发光免疫分析法（ECLIA）电化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量定性。 化学发光免疫分析（CLIA）高度敏感，可达pgml或pmol水平；特异性强，重复性好。测定范围宽，可达7个数量级。试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。操作简单，耗时短，易于自动化。在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。化学发光免

22、疫分析（CLIA）应用实例吕干新、何伟珍等人化学发光免疫分析法测定地高辛血药浓度结果分析钟筑宁、谷俊莹等人化学发光免疫分析法与放射免疫分析法测定性激素的评价荧光免疫分析FIA 是以荧光物质作为标记物与待测药物结合，所形成的荧光标记物能与抗体发生免疫反应 ，引起荧光强度发生变化的一种分析方法。 按产生荧光的方式不同 1.底物标记荧光免疫分析2.荧光偏振免疫分析3.荧光淬灭免疫分析4.荧光增强免疫分析5.时间分辨荧光免疫分析底物标记荧光免疫分析(FPLA) 用一种本身不能发出荧光的酶底物来标记药物，当酶底物受到相应酶作

23、用时，能裂解产生荧光，其荧光强度与待测药物含量成正比。荧光偏振免疫分析( FPIA) 用一定波长的激发偏振光照射荧光物质，然后利用物质吸收光能后所发射出的偏振荧光强度来测定样品中待测组分含量的一种分析方法。荧光偏振免疫分析( FPIA)荧光偏振免疫测定方法评价：样品用量少荧光素标记试剂稳定，使用寿命长重复性好快速，易自动化适于小、中等分子物质检测荧光偏振免疫测定方法评价灵敏度较非均相荧光免疫测定法低荧光偏振免疫分析( FPIA) 目前应用最多的是FPIA，是一种新型的竞争性免

24、疫分析方法 ，相对于传统的酶联吸附免疫分析 (ELISA) ，FPIA是均相的反应体系，不需要分离结合和未结合的抗体，其已在药物检测领域得到了初步应用，主要用于测定药物、激素等物质，是用于治疗药物监测的最新检测技术。 荧光淬灭免疫分析FQIA 是利用游离标记药物具有荧光，当其与抗体结合之后即失去荧光这一性质来测定样品含量的一种荧光分析方法。 荧光增强免疫分析FEIA 是利用荧光标记药物与抗体结合之后，能使其荧光强度增强的性质来测定样品的含量。时间分辨荧光免疫分析TRFIA T

25、RFIA 技术是以镧系元素为示踪剂，用具有双功能基团的镧系元素标记抗原或抗体，当与抗体或抗原结合时，抗原抗体复合物在增强液中解离，在特定激发光激发下发出特定波长的荧光。用时间分辨荧光仪测定复合物中稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测样品中抗原或抗体的浓度值，以达到定量分析的目的。 时间分辨荧光免疫分析TRFIA 与以往的放射免疫分析法相比，镧系元素具有以下特点：激发光谱带宽，可以增加激发能，提高灵敏度；发射光谱带窄，减少非特异荧光，可有效降低本底荧光，且能量损失也不大；镧系离子鳌合物的荧光寿命很长，镧系离子由激发态跃迁到基态时发射荧光，在测量时间内可反复激发镧系离子，相当于大大提高了标记比活性

26、；标记物比较稳定，可以保存1-2年。时间分辨荧光免疫分析TRFIA应用举例：李慧萍、段巧艳 时间分辨荧光免疫分析 法检测乙型肝炎病毒血清标志物研究 国内最常用的HBV感染者的血清学标志物检测主要依靠酶联免疫吸附试验（ELISA），它只能对HBV 血清学标志物做定性或半定性分析，而且操作过程中受多种因素影响。ELISA 检测结果准确度降低，时间分辨荧光免疫分析TRFIA甚至出现假阳性、假阴性结果。尤其目前ELISA 法不能用于定量测定，局限了其应用。 TRFIA 灵敏度高，特异性强，对于乙型肝炎两对半定量检测，能够准确、及时、灵敏地反映患者体内的HBV 病毒标志物的含量。 微生物测定法（microbiological analysis，MA） 为生物检定法，它是利用药物（常为 抗生素）对于微生物的抑制或杀灭作用，通过选择对药物敏感的试验菌，在适当的条件下，根据培养基上所产生的抑菌圈的大小来测定药物效价的方法。