串联质谱在新生儿筛查中应用进展

1、串联质谱用于遗传代谢病的筛查诊断, 是开展苯丙酮尿症筛查以来新生儿筛查史上最重要的进展。它 主要通过稳定性同位素【用】标记在12种氨基酸和8种酰基肉碱(Cambridge Isotope Laboratories,Inc)上作为标准参照物来进行定量分析，筛查出包括氨基酸病、有机酸代谢紊乱和脂肪酸 氧化缺陷在内的30-40 种遗传代谢病, 大大提高了筛查效率, 实现了“一种实验检测一种疾病”到“一 种实验检测多种疾病”的转变。一、概述新生儿疾病筛查是指在新生儿期通过对某些危害严重的遗传代谢缺陷、先天性疾病进行群体 筛查, 早期及时发现，及时诊断，早期诊治,从而避免或减轻疾病的危害。始于20 世纪

2、60 年代早期的新 生儿疾病筛查，从Gut hrie的细菌抑制法到放射免疫分析法、酶免疫吸附实验等，都属于“一种实验检 测一种疾病”的方法。其间，虽然不断出现新的筛查技术如气相色谱质谱(GC/MS)、液相色谱质谱(L C/ MS)等，但所有这 些技术具有分析周期长、样品通量较低、假阳性较高等缺点， 不能满足大规模的新生儿疾病筛查。近年发展起来的串联质谱法( tandem mass spectrometry ，MS/ MS) 具有快速、灵敏和选择性强等特 点，自从应用于新生儿疾病筛查以来,大大扩展了筛查的疾病谱。MS/ MS主要通过对新生儿干血滤纸片中 的氨基酸、有机酸、酰基肉碱的分析， 一次实

3、验可以同时筛查出包括氨基酸病、有机酸代谢紊乱、脂肪酸 氧化缺陷在内的30-40种遗传代谢病， 大大提高了筛查效率。二、MS/ MS的基本原理:质谱主要是将被测物质分子电离成各种质荷比(m/ z )不同的带电粒子，然后 应用电磁学原理， 使这些带电粒子按照质荷比大小的空间在时间上产生分离依次排列通过四级杆而成的图 谱，通过测定在单位时间内带电粒子峰的强度，以此获得确定化合物的分子量、分子式。MS/ MS是由2 个质谱室经1个碰撞室串联而成，其进行新生儿疾病筛查的原理Milli ngt on 1 ,2 和Ras hed3 ，4 都作了相应的报道。三、MS/ MS的筛查样品准备：MS/ MS分析的样

4、品是采用干血滤纸片，在上MS/ MS仪前样本处理分为衍生法和非衍 生法，干血滤纸片经打孔后置于96 孔板中,加入同位素内标, 经甲醇抽提, 氮气吹干,在经过盐酸-乙酰 氯衍生化后，再次氮气吹干完全干燥，溶解于有机相中，进行上MS/ MS仪测定。其中同位素内标的使用是 MS/ MS 定量分析的标准参照物， 同位素内标分子量分布相对于被测物而言是尽可能宽的，同时也应考虑同 位数内标之间相互干扰等因素，才能达到既互不干扰又分析准确。如在酪氨酸分析中，使用13C6 -环- 酪氨酸作内标，不会随储存时间而衰减，因此比酪氨酸-d4更稳定5;用赖氨酸-dlO代替赖氨酸-d3可 以减少谷胺酰氨-d5的中性碎片

5、丢失中的脱氨基产物对赖氨酸-d3的碎片离子的影响。各种软离子技术, 尤其是电喷雾电离(ESI)与MS/ MS相结合，降低了对样品的纯度要求，而且使得进样自动化，从而适 应了新生儿疾病筛查高通量的要求。MS/ MS分析：应用于新生儿疾病筛查的MS/ MS主要执行3个扫描模式:母离子扫描、中性丢失 扫描和选择反应检测或多反应检测。在母离子扫描中， 第二个质谱室选择特征的碎片离子， 测定第一个质 谱室中的所有母离子。在中性丢失扫描中， 2个质谱室在同样的速度和方式下扫描，测得的质谱强度显示 出具有相同的碎裂方式的离子。在进行选择反应检测时， 2个质谱室是静止的，对每一样品有选择地检测 某些母离子-

6、碎片离子对。数据获取的方法依据分析目的不同而不同。它可以是单一的功能扫描， 如氨基 酸的中性丢失扫描和酰基肉碱的母离子扫描，也可以是多反应检测分析。大多数a-氨基酸在碰撞诱导裂 解(CID)作用下产生102Da的中性碎片丢失，少数氨基酸产生56Da (甘氨酸)、161Da (精氨酸)、 119Da(鸟氨酸)的中性碎片丢失，因此氨基酸分析一般采用中性丢失扫描。而在酰基肉碱分析中，因其结 构特点与氨基酸不同，经CID后产生的是具有共同结构的85Da的碎片离子，所以主要采用母离子扫描方 式。但如果同时进行氨基酸和酰基肉碱分析， 较理想的分析应该是多反应检测分析与母离子扫描或中性丢 失扫描相结合使用，

7、 并且在某些关键的物质分析中几种方式同时使用。每一扫描功能的数据获取过程有一 定的时间分配， 主要依据样品流量、扫描质量范围、扫描速度、相应分析物的量、所需求的数据质量及其 他参数而定。通过使用所谓的计算机辅助的代谢图谱运算法(CAMPA)的自动化分析系统来变换不同的设备 模式处理复杂的数据， 能够在2分钟内精确地分析不同物质的组成， 从而更能适应高通量的新生儿疾病筛 查。MS/ MS 结果处理： 遗传代谢病是由于人体内某些酶、膜或受体等生物合成的遗传缺陷， 引起细胞 和体液内毒性中间产物积聚或必需代谢产物的缺乏， 在血液中表现为相应代谢物如氨基酸、酰基肉碱的含 量增高或缺乏。MS/ MS结果

8、处理的一个重要方面是将代谢物质谱转换成有意义的临床结果，这一过程主 要通过计算代谢物离子率而得， 即未知代谢物的丰度与相应内标丰度之比， 然后在预先建立的标准曲线上 将比率转换成浓度， 以筛查诊断相应的遗传代谢缺陷病。也可采用相应的几种代谢物之间的离子峰丰度比 来分析。方法的选择对结果分析有很大的影响，如在苯丙酮尿症(P KU)筛查中，使用Phe/ Ty r比的 精确性优于Phe离子率，而且还可区分引起苯丙氨酸升高的几种情况：经典的PKU、BH4缺乏引起的P KU、一过性的苯丙氨酸升高。而在丙酸血症筛查中，因为乙酰肉碱(C2)在m/z 260的质谱信息可能受 到谷氨酸双丁基脂的干扰，因此使用丙

9、酰内碱(C3)离子率比用C3/C2更有意义。MS/MS结果分析也受到不 同因素的影响，如肉豆蔻酰肉碱(C14)、棕榈酰肉碱(C16)在早产儿中的浓度下降，而对于因母亲营养障 碍导致的早产儿其Phe / Tyr率却有所增高3 。酪氨酸浓度升高除酪氨酸血症I型所致外，还见于其他 疾病，所以在酪氨酸血症I型的分析筛查时，当仅仅酪氨酸浓度升高，可通过快速分光光度仪间接地检测 琥珀酰丙酮酸来加以分析，以排除其他疾病11 。MS/ MS还不能很好地区分同分异构体，如在5碳酰基 肉碱分析中，甲基丁酰肉碱和异戊酰肉碱(C5)有着同样的质量和相应的C5标记，因此C5既可以表示2-甲基丁烷辅酶A脱氢酶缺乏，也可表

10、示异戊二酸血症，这时就需要其他技术(如气相色谱技术)分析各 自的代谢产物(分别为甲基丁酰肉碱和异戊酰肉碱)。在枫糖尿症(MSUD)的筛查中，m/ Z188的丰度既可 以是亮氨酸、异亮氨酸，也可以是别构异亮氨酸， 尤其还存在羟脯氨酸、丙酰甘氨酸的干扰， 对于经验不 丰富的操作者来说更加难以区分，但如使用多级串联质谱(如L C/ MS/ MS)则可避免这一问题。新生儿疾病筛查的扩展：虽然MS/ MS早在1990年就已应用于新生儿疾病筛查，但直到最近几年 才在一些发达国家作为常规使用。随着技术的发展和对遗传代谢病认识的深入, 不断地有新的疾病加入 MS/ MS 分析的行列， 能够筛查包括属于氨基酸病

11、， 属于有机酸代谢紊乱及属于脂肪酸氧化缺陷的等大约 3040多种疾病。尤其是脂肪酸氧化缺陷在最近几年逐渐得到重视，估计3 %6%的婴儿猝死综合征可 能是由脂肪酸氧化缺陷所引起，因此不断地有作者通过MS/ MS把这类疾病列入新生儿疾病筛查中。假阳性与假阴性： MS/ MS 技术优于其他技术的特点之一就是大大降低了筛查诊断的假阴性和假阳 性， 尤其对已作为常规筛查的疾病。有报道筛查苯丙酮尿症数十万例， 达到了零错误率。但对于某些有机 酸代谢紊乱、脂肪酸氧化缺陷病来说,MS/MS还不能作为一个诊断实验。有人曾报道1例戊二酸血症I型 的病人出现MS/MS分析假阴性的情况。此外，如果母亲在分娩前使用过含

12、有三甲基醋酸的抗生素，就可 导致新生儿血液中含有与异戊酰肉碱有同样分子量的三甲基醋酸酰肉碱含量升高，从而导致异戊酸血症诊 断的假阳性。四、MS/ MS对其他遗传代谢病的分析：MS/ MS除了用于氨基酸病、有机酸代谢紊乱和脂肪酸氧化缺 陷筛查外，还可用于溶酶体贮积症(LSD)的诊断分析，已证实硫酸脑苷脂在异染性脑白质营养不良、葡糖脑 苷脂在戈谢氏病中皆可以通过MS/ MS分析18 。也有人试图利用对干血滤纸片中结合胆汁酸的定量分 析来筛查胆汁淤积的肝胆管性疾病， 但由于结合胆汁酸与氨基酸、酰基肉碱的理化性质不一样， 其标本必 须在出生后710天且在食后23 小时开始采集，同时标本应避光保存， 才能保证筛查的准确性， 因此 还存在许多有待解决的问题。综上所述， MS/ MS 技术正迅速地成为新生儿群体筛查的有力工具， 随着各 国科学家的努力，将会有更多的疾病可以通过MS/ MS分析筛查,并且技术也会更趋于成熟。1.Milli nt on DSNowood DL ， KodoN ，etal .Anal Biochem， 1989，180:331 -339.2.Milli nt on DSKodo N ， NorwoodDL， etalJ I nhe ri