生物化学酶的作用机制和酶的调节市公开课获奖课件

1、-1-7上海大学生命科学学院第十章 酶作用机制和酶调整一、酶活性部位二、酶催化反应独特性质三、影响酶催化效率相关原因四、酶催化反应机制实例五、酶活性调整控制六、同工酶第1页第1页-1-7上海大学生命科学学院一、酶活性部位活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用少数氨基酸残基，包括底物结合部位（决定酶专一性）、催化部位（决定酶所催化反应性质）。频率最高活性中心氨基酸残基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。不需要辅酶酶：活性中心是酶分子在三维结构上比较靠近少数几种氨基酸残基或是这些残基一些基团。 需要辅酶酶：辅酶分子或辅酶分子某一部分结构往往就是活性中心构成部分。（一）酶活性部

2、位特点第2页第2页-1-7上海大学生命科学学院接触残基：R1、R2、R6、R8、R9、R163辅助残基：R3、R4、R5、R164、R165结构残基：R10、R162、R169非奉献残基：其它第3页第3页-1-7上海大学生命科学学院酶蛋白必需残基非必需残基活性中心活性中心外接触残基辅助残基结构残基结合残基催化基团（1）接触残基：结合基团，催化基团。（2）辅助残基：不与底物接触，辅助酶与底物结合，帮助接触残基。上述两类残基构成酶活性中心。（3）结构残基：维持酶分子三维构象，与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外必需残基。上述三类残基统称酶必需基团（4）非奉献残基（非必需基团）也

3、许在免疫，酶活性调整，运送转移，预防降解等方面起作用。 第4页第4页-1-7上海大学生命科学学院酶活性部位特点：（1）活性部位在酶分子总体中只占相称小部分，往往只占整个酶分子体积1%-2% ；（2）酶活性部位是一个三维实体，含有三维空间结构。 活性中心空间构象不是刚性，在与底物接触时表现出一定柔性和运动性。（邹承鲁研究酶变性工作）（3）通过诱导契合酶和底物结合；（4）酶活性部位是位于酶表面一个裂隙内，裂隙内是一个相称疏水环境，从而有助于同底物结合；（5）底物通过次级键较弱力结合到酶上。第5页第5页-1-7上海大学生命科学学院（二）研究酶活性部位办法（1）通过酶专一性：研究酶专一性底物结构特点、

4、酶竞争性克制剂结构特点等。（2）酶化学修饰法：比如1.用共价修饰试剂作用于酶，查明保持酶活力必需基团；2.亲和标识（合成底物类似物）；3.SH保护剂使用。（3）X射线晶体衍射法（4）分子生物学办法第6页第6页-1-7上海大学生命科学学院二、酶催化反应独特性质（1）酶反应分为两类：仅涉及电子转移和涉及电子和质子两者或者其它基团转移。（2）催化作用是以氨基酸侧链上功效基团和辅酶为媒介。（3）酶催化反应最适pH范围通常狭小。（4）酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些，一个巨大酶结构对稳定活性部位构象是必要。（5）酶含有复杂折叠结构。第7页第7页-1-7上海大学生命科学学院三、影响酶催化效率相关

5、原因（一）底物和酶邻近效应与定向效应邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶催化基团与底物之间互相靠近，提升了反应基团有效浓度。定向效应：由于酶构象作用，底物反应基团之间、酶与底物反应基团之间正确取向效应。酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团互相邻近，同时使反应基团分子轨道以正确方位互相交叠，反应易于发生。第8页第8页-1-7上海大学生命科学学院邻近效应与定向效应对反应速度影响：使底物浓度在活性中心附近很高酶对底物分子电子轨道含有导向作用酶使分子间反应转变成份子内反应邻近效应和定向效应对底物起固定作用 第9页第9页第10页第10页-1-7上海大学生命科学学院

6、（二）底物形变和诱导契合酶中一些基团可使底物分子敏感键中一些基团电子云密度改变，产生电子张力，减少了底物活化能。酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。底物形变，利于形成ES复合物。底物构象改变，过度态结构，大大减少活化能。第11页第11页-1-7上海大学生命科学学院ZnZnGlu270Tyr248Arg145底物 羧肽酶结合底物前后构象改变第12页第12页-1-7上海大学生命科学学院（三）酸碱催化酶分子一些功效基团起瞬时质子供体或质子受体作用。影响酸碱催化反应速度两个原因酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼催化基团。给出质子或结合质

7、子速度。咪唑基最快，半寿期小于10-10秒第13页第13页-1-7上海大学生命科学学院（四）共价催化酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高共价中间物。酶亲核基团：Ser-OH，Cys-SH，His-N、Asp-COOH；底物亲电中心：磷酰基（-P=O），酰基（-C=O），糖基（Glu-C-OH）一些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也能够参与共价催化作用。催化剂通过与底物形成反应活性很高共价过渡产物，使反应活化能减少，从而提升反应速度过程，称为共价催化。第14页第14页-1-7上海大学生命科学学院（五）金属离子催化金属酶（metalloenzyme):含紧密结合金属离子，Fe2+

8、、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+。金属-激活酶（metal-activated enzyme):含松散结合金属离子，Na+、K+、Mg2+、Ca2+。金属离子参与四种主要催化路径（1）通过结合底物为反应定向（2）通过本身价数改变参与氧化还原反应（3）屏蔽底物或酶活性中心负电荷（4）金属离子通过水离子化增进亲核催化。第15页第15页-1-7上海大学生命科学学院（六）多元催化和协同效应在酶催化反应中，经常是几种基元催化反应配合在一起共同起作用。第16页第16页-1-7上海大学生命科学学院（七）活性部位微环境影响 疏水环境介电常数低，加强极性基团间作用。电荷环境在酶活性中心附近，往往有一电荷

9、离子，可稳定过渡态离子 第17页第17页-1-7上海大学生命科学学院四、酶催化反应机制实例（一）溶菌酶（lysozyme）NAG:N-乙酰氨基葡萄糖NAM:N-乙酰氨基葡萄糖乳酸第18页第18页 溶菌酶-底物复合物酶切位点第19页第19页溶菌酶活性中心与底物结合示意图Asp52Glu35（极性区）（非极性区）第20页第20页溶菌酶催化反应机理C1+非极性区极性区HO - E环H2O（广义酸碱催化）第21页第21页-1-7上海大学生命科学学院（二）RNase A RNase-底物复合物第22页第22页RNase活性中心酸碱催化机理第23页第23页核糖核酸链受Rnase水解位点第24页第24页-1

10、-7上海大学生命科学学院（三）羧肽酶 A 羧肽酶活性中心Zn2+中心作用第25页第25页-1-7上海大学生命科学学院羧肽酶活性中心必需基团与底物间结合第26页第26页-1-7上海大学生命科学学院ZnZn羧肽酶结合底物前后构象改变第27页第27页-1-7上海大学生命科学学院羧肽酶活性中心共价催化机理 145第28页第28页-1-7上海大学生命科学学院（四）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）胰凝乳蛋白酶分子中催化三联体构象His57Asp102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195A.酶分子中电荷中继网B.加上底物后，从Ser转移一个质子给His，带正电荷咪唑基

11、通过带负电荷Asp静电互相作用被稳定Ser195102AspHis57底物第29页第29页-1-7上海大学生命科学学院氢键体系-电荷中继网第30页第30页胰凝乳蛋白酶反应详细机制（1）结合底物His57 质子供体形成共价ES复合物C-N键断裂底物第31页第31页胰凝乳蛋白酶反应详细机制（2） 氨基产物释放四周体中间物崩溃水亲核袭击羧基产物释放H2OR-NH2第32页第32页-1-7上海大学生命科学学院五、酶活性调整控制（一）别构调控概念：酶分子非催化部位与一些化合物可逆地非共价结合后造成酶分子发生构象改变，进而改变酶活性状态，称为酶别构调整(allosteric regulation)，含有这

12、种调整作用酶称别构酶(allosteric enzyme)。别构酶促反应底物浓度和反应速度关系不符合米氏方程，呈S型曲线。凡能使酶分子发生别构作用物质称为效应物(effector)，通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构造成酶活性增长物质称为正效应物(positive effector)或别构激活剂，反之称负效应物(negative effector)或别构克制剂。别构调整普遍存在于生物界，许多代谢路径关键酶利用别构调整来控制代谢路径之间平衡，研究别构调控有主要生物学意义。第33页第33页A-非调整酶B-正协同别构酶 S形曲线 别构酶与米氏酶动力学曲线比较当底物浓度发生很小改变时，别构酶就极大地

13、控制着反应速度。在正协同效应中使得酶反应速度对底物浓度改变极为敏感。第34页第34页-1-7上海大学生命科学学院区别酶类型有两种原则a. Koshland原则：CI（cooperativity index）协同指数：酶分子中结合位点被底物饱和90%和10%时底物浓度比值。亦称饱和比值Rs(saturation ratio) Rs= 酶与底物结合达90%饱和度时底物浓度酶与底物结合达10%饱和度时底物浓度 Rs=81 米氏类型酶 Rs81 含有正协同效应别构酶 Rs81 含有负协同效应别构酶b.Hill系数： Hill系数=1 米氏类型酶 Hill系数1 含有正协同效应别构酶 Hill系数1 含

14、有负协同效应别构酶第35页第35页1-非调整酶2-正协同别构酶3-负协同别构酶 正、负协同别构酶与非调整酶动力学曲线比较含有负协同效应酶在底物浓度较低范围内酶活力上升快，但再继续下去，底物浓度虽有较大提升，但反应速度升高却较小。使得酶反应速度对底物浓度改变不敏感第36页第36页天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）ATCaseATP+氨甲酰磷酸天冬氨酸CTP-UTPUMP氨甲酰天冬氨酸第37页第37页-1-7上海大学生命科学学院E.coliATCase亚基排列c:催化亚基（catalytic subunit）r:调整亚基（ regulative subunit）第38页第38页-1-7上海大学生命

15、科学学院ATCase半分子（c3r3)结构第39页第39页-1-7上海大学生命科学学院ATCase别构过渡作用低催化活性构象T(tense) - 态CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性构象R(relax) -态R RR RR RPALA第40页第40页-1-7上海大学生命科学学院PALA(N-磷乙酰-L-天冬氨酸)结合到ATCase活性中心模型第41页第41页ATCase变构效应动力学特性ATP（正效应剂）CTP（负效应剂）低催化活性构象T(tense) - 态CCCCCC R R R R R RCCCCCC高催化活性构象R(relax) -态R RR RR RVmax1

16、/2VmaxKm第42页第42页别构酶齐变模型SSSSSSSSSST状态（对称亚基）R状态（对称亚基）SSSS对称亚基对称亚基齐步改变第43页第43页-1-7上海大学生命科学学院别构酶序变模型SSSSSSSSSSSSSS亚基所有处于R型亚基所有处于T型依顺序改变第44页第44页-1-7上海大学生命科学学院（二）酶共价修饰 一些酶能够通过其它酶对其多肽链上一些基团进行可逆共价修饰，使其处于活性与非活性互变状态，从而调整酶活性。这类酶称为共价修饰酶。当前发觉有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢路径，成为对代谢流量起调整作用关键酶或限速酶。 由于这种调整生理意义广泛，反应灵敏，

17、节约能量，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经指令，造成级联放大反应，因此日益引人注目。 AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g关键酶（限速酶）P2第45页第45页-1-7上海大学生命科学学院蛋白质磷酸化和脱磷酸化 蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质Pn蛋白磷酸酶nPiH2O第一类：Ser/Thr型第二类：Tyr型 第一类：Ser/Thr型 第二类：Tyr型 第三类：双重底物型第46页第46页反应类型 共价修饰 被修饰氨基酸残基共价修饰反应例子磷酸化腺苷酰化尿苷酰化Tyr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化GluS-腺苷-MetS-腺苷-同型 Cys第47页第47页A

18、TP ADP肾上腺素或胰高血糖素132102104106108葡萄糖456 级联系统调控糖原分解示意图意义：由于酶共价修饰反应是酶促反应，只要有少许信号分子（如激素）存在，即可通过加速这种酶促反应，而使大量另一个酶发生化学修饰，从而取得放大效应。这种调整方式快速、效率极高。肾上腺素或胰高血糖素1、腺苷酸环化酶（无活性）腺苷酸环化酶（活性）2、ATPcAMPR、cAMP3、蛋白激酶（无活性）蛋白激酶（活性）4、磷酸化酶激酶（无活性）磷酸化酶激酶（活性）5、磷酸化酶 b（无活性）磷酸化酶 a（活性）6、糖原6-磷酸葡萄糖1-磷酸葡萄糖葡萄糖血液ATP ADP（极微量）（大量）第48页第48页-1-

19、7上海大学生命科学学院（三）酶原激活体内合成出来酶，有时不含有生物活性，通过蛋白水解酶专一作用后，构象发生改变，形成活性中心，变成有活性酶。这个不具活性蛋白质称为酶原（zymogen或proenzyme），这个过程称为酶原激活。 该改变过程，是生物体一个调控机制。这种调控作用特点是，蛋白质由无活性状态转变成活性状态是不可逆。第49页第49页-1-7上海大学生命科学学院牛胰蛋白酶第50页第50页胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶活性中心胰蛋白酶原激活示意图第51页第51页胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶激活作用胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶第52页第52页-1-7上海大学生命科学学院六、同工酶存在于同一个属或不同种属，同一个体不同组织或同一组织、同一细胞，含有不同分子形式但