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1、第 三 章 酶化学(Chemistry of Enzyme)第1页第1页本章重点及难点重点：理解酶作为生物催化剂特点、国际命名；理解酶催化作用机理 ；掌握酶促反应动力学中米氏方程及Km意义、应用，掌握影响酶促反应动力学原因及与影响酶催化高效性原因之间区别。掌握别构酶特点及核酶、同工酶、诱导酶等概念。难点：酶催化作用机理 、各原因对酶促反应速度影响及酶促反应动力学应用。第2页第2页第一节 通 论第3页第3页一、酶学研究历史公元前两千多年，我国已有酿酒记载。一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动结果。1877年，Kuhne初次提出Enzyme一词。1897年，Buchner弟兄用不含

2、细胞酵母提取液，实现了发酵。1926年，Sumner初次从刀豆中提纯出脲酶结晶。1982年，Cech初次发觉RNA也含有酶催化活性，提出核酶(ribozyme)概念。1995年，Jack W. Szostak研究室首先报道了含有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。第4页第4页 二、什么是酶？ 酶是由活细胞产生，能在体内或体外起同样催化作用一类含有活性中心和特殊构象生物大分子，包括蛋白质和核酸，是生物催化剂。 三、酶与普通催化剂共性及特性 1、共性（1）不发生质、量改变，但能 改变反应速度（2）不改变反应平衡点，但能 缩短反应时。（3）可减少反应活化能（4）只

3、能催化热力学允许反应 2、个性（1）极高催化效率（2）高度专一性（3）易失活（4）酶活性可调控（5）催化作用与结构相关第5页第5页 酶专一性类型1. 结构专一性 酶对所催化分子（底物，Substrate）化学结构特殊要求和选择 类别：绝对专一性和相对专一性2. 立体异构专一性 酶除了对底物分子化学结构有要求外，对其立体异构也有一定要求 类别：旋光异构专一性和几何异构专一性第6页第6页四、酶作用专一性假说(1)、锁钥学说（模板学说） (2)、多位点亲和理论(3)、诱导契合学说第7页第7页(3)、诱导契合学说第8页第8页五、酶命名和分类1. 命名：习惯命名；系统命名2. 国际系统分类法及编号 *国

4、际生物化学会酶学委员会（Enzyme Commsion）将酶分成六大类：1.氧化还原酶类，2.转移酶类，3.水解酶类，4.裂解酶类，5.异构酶类，6.合成酶类 * 每一个酶有一个编号,如乙醇脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27 大类 亚类 亚亚类 序号第9页第9页 第二节 酶分子结构与功效第10页第10页酶简朴酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。 结合酶酶蛋白辅助因子（简朴蛋白质）（结合蛋白质）（apoenzyme）（cofacter)辅酶（coenzyme)辅基(prosthetic group)全酶(holoenzyme）= 酶蛋白 + 辅助因子一、酶构成第11页第11页*各部分成份在

5、催化反应中作用酶蛋白决定反应专一性辅助因子决定反应种类与性质金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。 金属激活酶(metal-activated enzyme) 金属离子为酶活性所必需，但与酶结合不甚紧密。 第12页第12页辅助因子分类（按其与酶蛋白结合紧密程度） 辅酶 (coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤办法除去。 辅基 (prosthetic group):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤办法除去。第13页第13页或称活性部位，酶分子中直接和底物结合并起催化反应空间局限（部位）。1. 酶活性中心（结合部位和催化部位）二、酶分子结构特

6、性 结合部位 酶分子中与底物结合部位或区域普通称为结合部位，结合部位决定酶专一性。第14页第14页催化部位 酶分子中促使底物发生化学改变部位称为催化部位，催化部位决定酶所催化反应性质。 第15页第15页活性中心特点 活性部位只占酶整个分子很小部分。通常只有几种aa残基构成。 酶活性中心是个三维实体，是在酶高级结构中形成，酶活 性中心aa残基在一级结构也许相距很远，但在空间结构上十分靠 近。 酶与底物结合是活性部分与底物形状发生诱导锲合过程。 酶活性部位位于酶分子表面一个裂缝内，底物分子就结合到这 个裂缝内，裂缝内含较多疏水基团，有助于结合催化。 酶活性中心是可运动性，酶活性中心与底物结合通过次

7、级键。第16页第16页AspHisSer胰凝乳蛋白酶活性中心活性中心主要基团: His57 , Asp102 , Ser195第17页第17页 2. 必需基团指酶表现催化活性不可缺乏基团，指在活性中心之外一些区域，不与底物直接作用。 第18页第18页底 物 活性中心以外必需基团结合基团催化基团 活性中心 第19页第19页三、与酶高效率相关主要原因（策略） 1、 邻近与定向效应 2、 诱导契合与底物扭曲变形 3、 共价催化 4、 酸碱催化 5、微环境影响第20页第20页酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化功效基团第21页第21页胰凝乳蛋白酶反应详细机制（1）结合底物His57 质子供体形成共价ES复

8、合物C-N键断裂底物第22页第22页胰凝乳蛋白酶反应详细机制（2）羰基产物释放四周体中间物崩溃水亲核袭击羧基产物释放第23页第23页第三节酶促反应动力学第24页第24页本节需要处理问题底物浓度与酶促反应速度影响酶浓度对酶促反应速度影响pH对酶促反应速度影响温度对酶促反应速度影响激活剂对酶促反应速度影响克制剂对酶促反应速度影响第25页第25页一、底物浓度对反应速度影响（一）、曲线基本含义单底物、单产物反应酶促反应速度普通在要求反应条件下，用单位时间内底物消耗量和产物生成量来表示反应速度取其初速度，即底物消耗量很小（普通在5以内）时反应速度底物浓度远远不小于酶浓度在其它原因不变情况下，底物浓度对反

9、应速 度影响呈矩形双曲线关系。第26页第26页当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。SVVmax第27页第27页伴随底物浓度增高反应速度不再成正百分比加速；反应为混合级反应。SVVmax第28页第28页当底物浓度高达一定程度反应速度不再增长，达最大速度；反应为零级反应。SVVmax第29页第29页（二）米氏方程式第30页第30页第31页第31页中间产物 1.快速平衡理论与稳态平衡理论E + S k1k2k3ESE + P快速平衡理论 19 Michaelis和Meuten 提出，当底物浓度远远不小于酶浓度时，假定ES分解成产物逆反应可忽略不计，因此在“快速平衡”理论基础上推

10、倒出一个数学方程式，以表示底物浓度与酶反应速率之间定量关系，称为米氏方程。稳态平衡理论 1925年Briggs和Haldane提出，反应进行一段时间后，ES浓度增长到一定值时，ES也在不断分解，只有当ES生成速度与分解速度相等时，ES浓度才保持不变，并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程。第32页第32页 2. 什么是米氏方程式？ 19Michaelis和Menten在快速平衡理论基础上提出反应速度与底物浓度关系数学方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)，1925年Briggs和Haldane在稳态平衡理论基础上并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程S：底物

11、浓度 V ：反应速度 Vmax：最大反应速度m：米氏常数第33页第33页米氏方程推导令：将（4）代入（3），则：ES生成速度：，ES分解速度：即：则：(1)经整理得：由于酶促反应速度由ES决定，即，因此(2)将（2）代入（1）得：(3)当酶反应体系处于稳态时：当Et=ES时，(4)因此 第34页第34页当反应速度为最大反应速度二分之一时 Km值推导KmS * Km值等于酶促反应速度为最大反应速度二分之一时底物浓度，单位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax/2 第35页第35页Km意义 Km值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度二分之一时底物浓度。 意义：a

12、) Km是酶特性性常数之一；b) Km可表示酶对底物亲和力；c) 同一酶对于不同底物有不同Km值。 第36页第36页 Vmax意义定义：Vmax是酶完全被底物饱和时反应速度， 与酶浓度成正比。 意义：Vmax=K3 E 假如酶总浓度已知，可从Vmax计算 酶 转换数，即动力学常数K3。第37页第37页LineweaverBurk作图法 双倒数作图法。 1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax取米氏方程式倒数形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km3.米氏常数Km测定第38页第38页二、酶浓度对酶促反应速度影响 当SE，酶可被底物饱和情况下，反应速度与酶浓度成正比关系式为：V

13、 = K3 E第39页第39页三、温度对酶促反应速度影响(1)、一方面是温度升高,酶促 反应速度加快；(2)、另一方面,温度升高,酶 高级结构将发生变化或变性，导致酶活性减少甚至丧失； (3)、因此大多数酶都有一个最 适温度。 在最适温度条件 下,酶促反应速度最大。第40页第40页四、pH对酶促反应速度影响第41页第41页五、激活剂对酶作用影响 金属离子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+ 、 Co2+、Fe2+ 阴离子： Cl-、Br- 有机分子 还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金属螯合剂：EDTA定义：但凡能提升酶活性物质，称为酶激活剂。类别：第42页第

14、42页六、克制剂对酶反应影响酶克制作用 有些物质能与酶分子上一些必须基团结合（作用),使酶活性中心化学性质发生改变，造成酶活力下降或丧失。失活作用 凡可使酶变性而引起酶活力丧失作用。 克制剂 能够引起酶克制作用化合物。克制剂特点 a.在化学结构上与被克制底物分子或底物过渡状态相同。 b.能够与酶活性中心以非共价或共价方式形成比较稳定复合体或结合物。第43页第43页两者区别： 克制剂对酶克制作用有选择性，一种克制剂只能引起一种酶或一类酶活性丧失活减少，而蛋白质变性剂可使所有酶变性失活。在克制剂与酶结合而导致克制作用中，克制剂一般都具有下列特点：一方面在化学结构上与被克制酶底物分子或底物过渡态相似

15、（结构上）。另一方面能够与酶活性中心以非共价键或共价方式形成比较稳定复合体或结合物，而变性剂则作用方式较多。第44页第44页克制作用类型 非专一性不可逆克制 不可逆克制作用 专一性不可逆克制 克制作用 竞争性克制 可逆克制作用 非竞争性克制 反竞争性克制第45页第45页 (1)不可逆克制作用 克制剂与酶反应中心活性基团以共价形式结合，引起酶永久性失活。第46页第46页非专一性不可逆克制剂 克制剂作用于酶分子中一类或几类基团，这些基团中包括了必需基团，因而引起酶失活。类型：第47页第47页专一性不可逆克制剂 这类克制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心一些基团不可逆结合，引起酶活性丧失。 实

16、例：有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX第48页第48页（2）可逆性克制作用克制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶活性减少或丧失；克制剂可用透析、超滤等办法除去。竞争性克制非竞争性克制反竞争性克制 第49页第49页竞争性可逆克制一些克制剂化学结构与底物相同，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。竟争性克制通常能够通过增大底物浓度，即提升底物竞争能力来消除。动力学：Vmax不变；Km值增长，酶与底物亲和力减少。磺胺类药物设计 第50页第50页第51页第51页竞争性克制曲线第52页第52页 磺胺类药物抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶二氢蝶呤

17、啶 对氨基苯甲酸 谷氨酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸第53页第53页非竞争性可逆克制定义： 酶可同时与底物及克制剂结合，引起酶分子构象改变，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心结合，因此称为非竞争性克制剂。动力学：Vmax减小，Km不变，酶与底物亲和力不变。金属离子，EDTA等 第54页第54页第55页第55页非竞争性克制曲线第56页第56页定义：克制剂不与酶结合，只与ES复合物结合，引 、 起酶活性下降。动力学：km减少，酶对底物亲和力增长，最大反应 速度减少，也无法通过改变底物浓度而改 变反应克制剂影响。 举例：多底物反应中反竞争性克制作用第57页第57页第58页第58页反竞

18、争性克制曲线第59页第59页（一）、酶分离纯化普通原则与蛋白质相同 1、材料预处理； 2、破碎细胞； 3、蛋白质粗提（与杂质分开）； 4、将蛋白质沉淀出来（等电点、盐析法、有机溶剂法）； 5、粗制品纯化（凝胶过滤法、纤维素柱色谱法、亲和层系法）。七、酶分离纯化和活力测定第60页第60页1. 酶活力（enzyme activity, 也称酶活性） （二）、酶活力与测定 酶催化一定化学反应能力，用在一定条件下酶所催化反应反应速度来表示。 酶活力大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit, U），就是表示酶量多少单位。其表示办法与所有测定办法相关。 第61页第61页习惯上沿用单位如 :乳酸 + N

19、AD+ 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶活力可用丙酮酸增长量表示，也可用340nm光吸取增长量来表示。 第62页第62页2. 酶活力单位表示办法 国际单位(IU)：1961年 在最适条件下，每分钟催化1mol底物减少或产物生产所需酶量为一个国际单位。 催量单位(katal)：1972年 指在最适条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所需酶量。 1Kat6107IU ，能够以纳Kat、微Kat来进行换算。第63页第63页3测定酶活力时应注意几点 （1）应测反应初速度（2）酶反应速度普通用单位时间 内产物增长量来表示。 （3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子 强度和底物浓度等

20、原因保持恒定。 （4）测定酶反应速度时，应使SE。 产物浓度P(t)第64页第64页4. 酶活力测定办法 （1）分光光度法（spectrophotometry） 该法要求酶底物和产物在紫外或可见光部分光吸取不同。 如氧化还原酶类。简便、快速、准确。 一个样品可多次测定，有助于动力学研究。 可检测到10-9mol/L水平改变。 长处：第65页第65页习惯上沿用单位如 :乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶活力可用丙酮酸增长量表示，也可用340nm光吸取增长量来表示。 第66页第66页（2）荧光法（fluorometry） 该法要求酶反应底物或产物有荧光改变。

21、 主要长处：灵敏度很高，能够检测10-12mol/L样品。 酶蛋白分子中Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。 例：乙醇 + NAD+ 乙醛 + NADH + H+ 乙醇脱氢酶第67页第67页（3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay) 第一个酶产物为第二个酶底物，这两个酶系统在一起反应。 P1无光吸取或荧光改变，偶联后, P2有光吸取或荧光改变。第68页第68页例：测己糖激酶活性 葡萄糖 + ATP 葡萄糖-6-磷酸 + ADP 己糖激酶葡糖-6-磷酸 + NADP 葡萄糖酸-6-磷酸 + NADPH + H+

22、 G-6-P脱氢酶第69页第69页5. 酶比活力（specific activity，也称比活性） 比活力：指每mg蛋白质所含有酶活力，普通用U/mg蛋白 质来表示。 比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示。 比活力总活力单位数蛋白质总毫克数 活力单位数mg蛋白质 (杂蛋白:包括酶蛋白及含非酶蛋白） 比活力是酶纯度衡量主要指标之一第70页第70页终点法（终止法）：测定完毕一定量反应所需要时间，普通 测产物生成量比较好。动力学办法（连续法）：测定一定期间内所起化学改变量， 灵敏度较高。6、测定酶活力普通办法第71页第71页 1. 纯化倍数 2. 比活力 3. 回收率 （三）、如何衡

23、量纯化酶质量 第72页第72页 第 四 节 酶调整第73页第73页一 、酶原与酶原激活酶原 有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶无活性前体，以前体物质称为酶原。 酶原激活 在一定条件下，酶原向有活性酶转化过程。第74页第74页 酶原激活机理酶 原分子构象发生改变形成或暴露出酶活性中心 一个或几种特定肽键断裂，水解掉一个或几种短肽在特定条件下第75页第75页赖缬天天天天甘异赖缬天天天天缬组丝SSSS46183甘异缬组丝SSSS肠激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原激活过程第76页第76页 酶原激活生理意义避免细胞产生酶对细胞进行本身消化，并使酶在特定部位和环境中发挥作用，确保体内代谢正常进行。有酶原能够

24、视为酶储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性酶，发挥其催化作用。第77页第77页二、变构酶 变构酶（别构酶） 有些酶能够与一些化合物（称为变构剂）发生非共价结合，引起酶分子构象改变，对酶起到激活或克制作用，这类酶通常称为。 结构特点 活性中心（结合部位和催化部位）和变构中心（特殊调控部位）。 注意：变构中心不是酶活性中心构成部分。第78页第78页酶别构（变构）效应示意图效应剂别构中心活性中心第79页第79页调整物：也称效应物，普通指是酶底物或底物类似物 或代谢终产物。别构效应： 调整物与别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子某种构象，使酶活性中心对底物结合和催化作用受到影响，从而调整酶反应速

25、度代谢过程，这种效应称为别构效应。 正效应物：指效应物结合使酶活性升高，也称别构激活剂。 负效应物: 指效应物结合使酶活性减少，也称别构克制剂。 第80页第80页（1）常为多个亚基构成寡聚体；（2）含有别构效应；（3）动力学曲线不符合米曼方程双曲线；（4）酶分子上含两个中心或部位：活性中心 （活性部位）和别构中心（别构部位）。1963年，Monod等初次提出别构酶概念。他认为别构酶应具备下列特性：第81页第81页 同促效应：配体相同。当一个效应物与酶结合后， 影响另一相同效应物与酶结合。 异促效应：配体不同。当一个效应物与酶结合后， 影响另一不同效应物与酶另一部分结合。别构效应种类1、依据配体性质分第82页第82页2、协同效应 一个效应物分子与变构酶结合，对第二个效应 物分子结合产生影响，这种效应为协同效应。正协同效应：指效应物分子与变构酶结合后，本身构 象发生改变，有助于后续底物分子或调整 物分子结合。负协同效应：指效应物分子与变构酶结合后，本身构 象发生改变，不利于后续底物分子或调整 物分子结合。第83页第83页别构酶调整两种模型SSSSSSSSSSSSSS亚基所有处于R型亚基所有处于T型依顺序改变序变模型（KNW）：1966年由Koshland、Nemethy和Filmer 提出。 第84页第84页齐变模