食品安全检测技术

1、精品文档第一章样品的前处理技术超临界流体萃取的定义： 用超临界流体作为溶剂，用来有选择性地溶解液体或固体混合物中溶质的分离技术称为超临界流体萃取。超临界流体的性质： （ 1）超临界流体的传递性质超临界流体的密度与液体接近； 粘度与普通气体接近； 自扩散系数也远远大于一般液体。 因此，与一般溶剂相比，在超临界流体中，可更快进行传质，短时间内达到平衡，从而高效地进行分离。甚至可以简化固体粉末的预处理。（ 2）超临界流体的溶解性能超临界流体的密度接近液体超临界流体的密度接近液体，超临界流体对液体、固体的溶解度也与液体接近。超临界流体溶解能力与压力、温度及是否加入提携剂有关。提携剂的作用提携剂也称共溶

2、剂、修饰剂、改进剂, 是一种加入超临界流体系统中的少量溶剂, 它的加入能明显改变超临界流体系统的相行为 , 可增加溶解度；可降低操作压力或减少流体的用量P11P12PT2222P2PP1T21 T1212T1 T332T4T1 5434(a) 等温法(b) 等压法(c) 吸附法T1=T2P1P21 2P1=P2T1=T2 P1=P2TT共溶剂的作用 : 提高溶解度 ; 增加萃取1萃取槽2膨胀阀2加热器萃取槽吸收剂1萃取槽123分离槽4压缩机5冷却器分离槽过程的分离因素；提高溶解度对温度或压力的4敏感性。其作用机理可能是分子间的范德华力或形成氢键。4. 超临界萃取典型流程 ：超临界流体萃取过程基

3、本上由萃取阶段 和分离阶段 组成，右上图就是三种典型的流程。固相萃取的原理固相萃取 (Solid Phase Extraction，简称 SPE) ，也称固相提取，是一项结合了选择性保留、选择性洗脱等过程的分离技术。当复杂的样品溶液通过吸附剂时，吸附剂会通过作用力选择性地保留目标化合物或者干扰物，其他组分则透过吸附剂流出小柱，然后用另一种洗脱能力较强的溶剂体系选择性地把目标物洗脱下来，从而实现对复杂样品的分离、纯化和富集。6.固相萃取的作用：净化：去除干扰物，优化色谱图，增加定量准确性富集 ：浓缩样品增加灵敏度转换溶剂： 适合色谱分析保护色谱柱不受污染, 延长使用寿命固相萃取的操作程序： （活

4、化、上样、洗涤、洗脱）1）活化吸附剂 ：萃取之前要用适当的溶剂淋洗小柱，以使吸附剂保持湿润，可以吸附目标化合物或干扰化合物。2）上样（吸附）：倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空，加压或离心的方法使样品进入吸附剂。3）洗涤（去除杂质） ：在样品进入吸附剂，目标化合物被吸附后，可先用较弱的溶剂将弱保留干扰化合物洗掉4）洗脱（ 洗脱并收集目标物质 ）3、固相微萃取的原理（数学表达式） ， SPME的特点（集取样、萃取、富集、进样于一身） ；提高固相微萃取萃取效率的方法固相微萃取的原理（数学表达式）对于一个单组分的单相体系, 当被分析有机物在萃取头与萃取体系之间达到平衡时, 分析物与萃取头之间有

5、一分配系数K, 该分配系数与分.精品文档析物在萃取体系中的量有如下关系: （右图所示）式中 :N 为吸附于萃取头上分析物的量;C0为萃取前分析物在样品中的浓度;K为分析物在萃取头和样品间的分配系数;Cs为分析物在萃取后样品中的浓度;Cf为分析物在萃取头中的浓度;Vf为萃取头的体积;Vs为样品的体积。可以看出 , 体系中的 K 及 Vf值是影响方法灵敏度的重要因素。9. SPME 的特点（ 1）SPME 的特点 是集取样、萃取、富集、进样于一身。（ 2）SPME易于操作 , 是试样与固相涂层直接作用, 几乎不消耗溶剂, 降低了成本 , 保护了环境。 SPME 的速度取决于分析物分配平衡所需的时间

6、, 一般在 2 30 min 内即可达到平衡。该技术适用于微量或痕量组分的富集。（ 3）SPME是一种基于气固吸附( 吸收 )和液固吸附 ( 吸收 )平衡的富集方法, 利用分析物对活性固体表面( 熔融石英纤维表面的涂层)有一定的吸附( 吸收 )亲合力而达到被分离富集的目的。（ 4）SPME技术是根据有机物与溶剂之间的“相似者相溶” 的原则 , 利用石英纤维表面的色谱固定相或吸附剂对分析组分的吸附作用, 将组分从试样基质中萃取出来, 并逐渐富集 , 完成此试样前处理过程1 在进样过程中,利用气相色谱进样口的高温将吸附的组分从固定相中解吸下来, 由色谱仪进行分析。提高固相微萃取萃取效率的方法萃取过

7、程中不可避免地出现由于萃取涂层体积远远小于样品体积而在竞争吸附中造成萃取灵敏度低的问题。针对这种情况，可以采用下列几种方法解决：（ 1）加热样品提高待测物质的挥发度，加快传质速率。这时需要注意的一个问题是, 由于温度的升高，会使待测物在顶空与涂层间的分配系数下降，导致涂层吸附能力降低。所以，在实际操作中应选择一个最佳萃取温度或在加热样品的同时将萃取纤维用干冰冷却保护起来。减少顶空体积和不断搅拌样品也有利于提高萃取效率。对于土壤样品，在加热的同时还可以加入少量水或表面活性剂来作调节剂，以提高萃取效果。例如，在高温下涂层吸附含水10的土壤样品中的待测物要显著高于不含水的样品。（ 2）增加涂层的厚度

8、是提高吸附量、降低检测限的另一途径。而且不同涂层厚度适用的对象也不同。通常，涂层薄的石英纤维适合于萃取分子量大的化合物，而涂层厚的则适宜于易挥发和分子量小的化合物。3）衍生化 ：对于强极性待测物还发展了现场衍生化的方法，通过衍生反应来降低待测物的极性，使得易于分析。目前普遍使用的有两种衍生化方法先将衍生试剂加入待测样品中进行衍生化反应后再进行SPME处理；先将萃取纤维浸入衍生试剂中，待涂层中吸附了一定量的衍生试剂后进行 SPME处理，这时在纤维涂层上萃取过程和衍生化反应同时进行。为了提高高分子涂层对有机物的萃取能力，可以通过在水样中加入盐类（NaCl 、Na2SO4）调节样品离子强度达到这一目

9、的。由于非离子涂层只能有效萃取中性物质，所以，某些时候为了防止待测物质的离子化，还需要调节溶液的 pH值。在实际操作中，应根据所处理样品的不同而灵活选用各种方法。微波加热的原理微波被加热的介质是由许多一端带正电、另一端带负电的分子( 称为偶极子 ) 所组成。偶极子的摆动。电场迅速交替，偶极子的取向也随之改变，偶极子作迅速的摆动。摩擦生热。由于分子的热运动和相邻分子间的相互作用， 使偶极子的摆动受到阻碍， 产生摩擦并产热。(3) 产生呈瞬间集中的热量。超高频交替变换的电场（微波频率为915MHz和 2450MHz，1s 内有 9.15 次或 2.45 109 次的电场变化）引起分子频繁的摆动，其

10、摩擦产生呈瞬间集中的热量，从而能迅速提高介质的温度。.精品文档微波萃取与传统加热方式的差异传统的热萃取是以热传导、热辐射等方式由外向里进行；而微波萃取是通过偶极子旋转和离子传导两种方式里外同时加热。微波萃取的机理及影响因素机理：（ 1） 一方面微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介质，到达物料的内部维管束和腺胞系统。由于吸收微波能，腺胞内温度迅速上升，使其细胞内部压力超过细胞壁膨胀承受能力，细胞破裂。细胞内有效成分自由流出，在较低的温度条件下萃取介质捕获并溶解。通过进一步的过滤和分离，便获得萃取物料。（2）另一方面，微波所产生的电磁场加速被萃取部分成分向萃取溶剂界面扩散速率，用水作溶剂时，在微波场

11、下，水分子高速转动成为激发态，加速其热运动，缩短萃取组分的分子由物料内部扩散到萃取溶剂界面的时间，从而使萃取速率提高数倍，同时还降低了萃取温度，最大限度保证萃取的质量。（3）当微波能作用于分子上时， 促进了分子的转动运动， 分子若此时具有一定的极性，便在微波电磁场作用下产生瞬间极化，并以24.5 亿次 / 秒的速度做极性变换运动，从而产生键的振动、撕裂和粒子之间的相互碰撞，以促进分子活性部分（极性部分）更好地接触和反应，同时迅速生成大量的热能，促进细胞破裂，使细胞液流出来并扩散到溶剂中。微波萃取的影响因素（1）溶剂的影响（2）萃取时间的影响（3）萃取温度的影响（4）式样中水分或湿度的影响（5）

12、基体物质的影响第二章生物检测技术1. PCR 的过程（变性、退火、延伸）：(1)DNA 模板的解链（变性） 90 95， 30s理论上，在 90 左右能使 DNA双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在中性pH 情况下， DNA的完整性仍能很好保存。(2) DNA 单链与引物的退火（复性）5565 , 3045s引物与模板单链特异性结合 （较高的温度） ；不希望两条互补的模板单链结合在一起（ DNA引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率 DNA自身复性几率 ）。(3) 引物的延伸（新链DNA的合成） 70 75 ， 3060s （ 2kb)首次循环：引物从 3端开始延伸，延

13、伸片段的 5端为人工合成引物是特定的，3 端没有固定的终止点，长短不一。第二个循环：引物与新链结合，由于后者5端序列是固定的末端，意味着5端的序列就成为此次延伸片段3端的终止点。N 个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5端的限定，产物的序列是介于两种引物5端之间的区域。引物本身也是新生DNA链的一部分。PCR 的反应条件：1）预变性 ： 94 300s （高温起动 : 充分变性，防止非特异性扩增）2）变性 ： 90-95 ， 30s -60s3）退火 ： 55-65 30s-45s（ 4）延伸 ： 70-72 30-60s（2kb)25-35次 cycle 后，延长延伸（72 ，10min

14、；充分延伸 ),冷却至 4 或加入 EDTA至 10mmol/L 以终止反应。PCR 的反应试剂：（ 1）模板 ：单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA.精品文档模板 /100L 。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（ 2）引物浓度 ：0.2-1mol/L 。浓度过高易导致模板与引物错配, 反应特异性下降。（ 3） Taq DNA聚合酶 （ thermus aquaticus)： 0.5-2.5 U/50l 。酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。4） dNTP： dNTP浓度取决于扩增片段的长度，四种 dNTP

15、浓度应相等。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与 Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（ 5） Mg2+：Mg2+是 DNA聚合酶的激活剂，0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq 酶活性丧失、 PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的 Mg2+浓度。（ 6）标准的缓冲液： 10X buffer（ KCl、 Tris-HCl、MgCl2、 BSA或 DDT）7）无菌双蒸水或三蒸水8） 石蜡油或矿物油 :3050ul （

16、封闭、防止高温时液体的挥发）4、ELISA 基本原理； ELISA 测定方法的操作步骤及关键点ELISA 基本原理酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面；抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体；在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相抗原或固相抗体起反应；用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例；加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量与标本中受检物的量相关，用分光光度法进行定量。ELISA 测定方法的

17、操作步骤及关键点（ 1）加样： 在 ELISA 中除了包被外，一般需进行45 次加样。（ 2）保温： ELISA 中一般有二次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。3）洗涤： 洗涤在 ELISA 过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。4）比色： ELISA 板的实验结果可用肉眼观察，也可用酶标仪测定。肉眼观察也有一定准确性。5）结果判定： 用“ +”或“ - ”表示。超过规定吸收值的标本均属阳性，此规定的吸

18、收值是根据事先测定大量阴性标本取得的，是阴性标本的均值加两个标准差。直接以吸收值表示。吸收值越大，阳性反应越强，此数值是固定实验条件下得到的结果，而且每次都伴有参考标本。以终点滴度表示。将标本稀释，最高稀释度仍出现阳性反应，为该标本的滴度。以 P/N 表示。求出该标本的吸收值与一组阴性标本吸收值的比值，大于1.5 倍、 2 倍或 3 倍，即判为阳性。第三章食品中残留危害物质检测技术1、有机氯农药残留量的测定气相色谱法 (GB T 5009 19 2008) 原理、提取、净化的操作步骤、检测、计算；原理： 样品中六六六、滴滴涕经提取、净化后用气相色谱法测定，与标准比较定量。电子捕获检测器对于负电

19、极强的化合物具有较高的灵敏度 ( 检出限达 10-14g/ml) ，利用这一特点， 可分别测出微量的六六六和滴滴涕。 不同异构体和代谢物可同时分别测定。.精品文档薄层色谱法原理，操作步骤，测定，计算；.精品文档（ 1）原理： 样品中六六六、滴滴涕经有机溶剂提取，并经硫酸处理，除去干扰物质，浓缩，点样展开后，用硝酸银显色，经紫外线照射生成棕黑色斑点，与标准比较，可概略定量。2）操作步骤提取： 选择弱极性溶剂提取如石油醚、环己烷、丙酮等净化 ：10ml 提取液浓缩至 1ml ，加 0.1ml 浓硫酸， 盖上试管塞振摇数下， 打开塞子放气， 再振摇 0.5min ，于 1600r min 离心 15

20、min。上层清液供薄层色谱分析（ 3）测定：薄层板的制备：称取氧化铝G 4.5g ，加 1ml 硝酸银溶液 (10g L) 及 6ml 水，研磨至糊状， 立即涂在三块5cm 20cm的薄层板上，涂层厚度0.25mm，于 100烘 0.5h ，置于干燥器中，避光保存。点样： 离薄层板底端2cm 处，用针划一标记。在薄层板上点1 10 L 样液和六六六、滴滴涕标准溶液，一块板可点 3 4 个。中间点标准溶液，两边点样品溶液。也可用滤纸移样法点样。展开 ：在展开槽中预先倒入l0ml丙酮 - 己烷 (1+99) 或丙酮 - 石油醚 (1+99) 。将经过点样的薄层板放入槽内。当溶剂前沿距离原点10 1

21、2cm时取出，自然挥干。显色 ：将展开后的薄层板喷以10ml 硝酸银显色液，干燥后距紫外灯8cm 处照 10 20min ，六六六、滴滴涕等全部显现棕黑色斑点。A21000（ 4）计算：x2m2V4 /V3 1000式中：X2 -样品中六六六、滴滴涕及其异构体或代射物的 单一含量， mg kg；A2-被测定用样液中六六六或滴滴涕及其异构体或代谢物的单一含量, ng ;V3-样品浓缩液总体积 , mL ；V4 - 点板样液体积 , L； m2- 样品质量 , g2、有机磷农药残留量的测定方法气相色谱法原理，样品的预处理，检测（火焰光度检测器原理，重点），计算（ 1）原理 ：含有机磷的试样在富氢火

22、焰上燃烧时，能激发出HPO碎片，激发态的 P 元素发出波长为 526nm的特性光波，光波经滤光片选择后由光电倍增管接收，转换成电流信号，由放大器放大并记录下来，与标准样品进行比较定性、定量。2）样品的预处理试样制备 : 粮食：取样品粉碎，过 20 目筛制成粮食试样果蔬：取样品洗净，晾干，去掉非可食部分后制成待测试样农药提取 : 粮食：用乙睛、丙酮、氯仿或二氯甲烷等提取果蔬：用石油醚、苯、二氯甲烷或乙睛等提取油脂类：用石油醚、丙酮、二氯甲烷等提取净化提取物 : 目的：去除油脂、色素、蜡质等干扰物质。浓缩和定容 : 用旋转蒸发器浓缩至约2 ml ，浓缩液定量转移至5 25 ml 容量瓶中，加二氯甲

23、烷定容至刻度（ 3）检测（火焰光度检测器原理，重点）：当含有机磷的试样在检测器中的富氢焰上燃烧时，以HPO碎片的形式，放射出波长为526 nm 的特性光。吸取 2 5 ul混合标准液及样品净化液注入气相色谱仪，其中的有机磷农药气化后在载气携带下于色谱柱中分离。火焰光度检测器（FPD）的滤光片将非特征光谱滤除，特性光经由光电倍增管接收，转变成电信号，经微电极放大器放大后被记录下来，绘成“电信号时间曲线” 。以保留时间（ tR ）定性。以试样和标准的峰高或峰面积比较定量（ 4）计算 :.精品文档Xi ：i 组分有机磷农药的含量(mg kg)Ai;试样中 i 组分的峰面积，积分单位Asi:混合标准液

24、中i 组分的峰面积，积分单位V1:试样提取液的总体积(ml)V2: 净化用提取液的总体积(ml)V3:浓缩后的定容体积(ml)V4: 进样体积( l)Msi:进入色谱仪中的i 标准组分的质量(ng)M:样品的质量(g)速测卡法原理，结果判断方法1）原理： 如果蔬菜中含可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性的有机磷和氨基甲酸酯类农药，这种酶就不能被水解，从而无显色反应。在溶液中加入乙酰胆碱酯酶和显色剂，用此判断有机磷和氨基甲酸酯类农药残留是否存在。2）结果判断方法 ：结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制 ( 为阳性 ) 、未抑制（为阴性）表示。与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果。白色

25、药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。对阳性结果的样品，可用其它分析方法进一步确定具体农药品种和含量。3、氨基甲酸酯类农药HPLC同时测定蔬菜中三种氨基甲酸酯类农药测定原理，提取与净化测定原理 ：样品经提取、净化、浓缩、定容，微孔滤膜过滤后进样，用反相高效液相色谱分离，紫外检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。(2) 提取与净化： 取市场销售的新鲜蔬菜切碎混匀， 准确称取样品 25.0g 于碘量瓶中， 加入 50.0mL 丙酮，振荡 30min ，加入 8.0g 氯化钠，摇匀后，加入 50.0mL 二氯甲烷，振荡 30min 后，取出，加入 10g 无水硫酸钠摇匀，静置分层

26、后，取上清液 50.0mL，于蒸发皿中， 40氮吹至 2.0mL。将活性炭 - 氨基固相萃取柱用甲醇活化后，加入样品，用甲醇冲洗，收集洗脱液约10mL， 40氮吹至约1.0mL，加入 1.0mL 甲醇，吹至余0.5mL，重复 2 次后，将残留物用甲醇溶解定容至2.0mL甲酸酯 - 气相色谱（附有 FTD火焰热离子检测器）测定原理，提取与净化(1 ）测定原理 ：含氮有机化合物被色谱柱分离后在加热的碱金属片的表面产生热分解，形成氰自由基（CN*），并且从被加热的碱金属表面放出的原子状态的碱金属（Rb）接受电子变成 CN-，再与氢原子结合。放出电子的碱金属变成正离子，由收集极收集，并作为信号电流而被

27、测定。电流信号的大小与含氮化合物的含量成正比。以峰面积或峰高比较定量。(2 ）提取： 粮食样品：称取约40g 粮食试样，精确至0.001g ，置于 250mL具塞谁形瓶中，加入 2040g 无水硫酸钠（视试样的水分而定） 、100mL无水甲醇。塞紧，摇匀，于电动振荡器上振荡30min 。然后经快速滤纸过滤于量筒中，收集 50mL滤液，转入 250mL分液漏斗中，用50mL 5%氯化钠溶液洗涤量筒，并入分液漏斗中。蔬菜样品：称取 20g 蔬菜试样，精确至 0.001g ，置于 250mL具塞锥形瓶中，加入80mL无水甲醇，塞紧，于电动振荡器上振荡 30min。然后经铺有快速滤纸的布氏漏斗抽滤于2

28、50mL抽滤瓶中， 用 50mL无水甲醇分次洗涤提取瓶及滤器。将滤液转入 500mL分液漏斗中，用 100mL 5%氯化钠水溶液分次洗涤滤器，并入分液漏斗中。(3 ）净化：粮食样品：于盛有样品提取液的250mL分液漏斗中加入50mL石油醚，振荡 1min ，静置分层后将下层（甲醇氯化钠溶液）放入第二个 250mL 分液漏斗中，加 25mL甲醇氯化钠溶液于石油醚层中，振摇30s ，静置分层后，将下层并入甲醇氯化钠溶液中。蔬菜样品：于盛有样品提取液的500mL分液漏斗中加入50mL石油醚，振摇 1min、静置分层后将下层放入第二个500mL分液漏斗中，并加入 50mL石油醚，振摇 1min，静置分

29、层后将下层放入第三个500mL分液漏斗中。然后用25mL甲醇氯化钠溶液依次反洗第一、二分液漏斗中的石油醚层， 每次振摇 30s ，最后把甲醇氯化钠溶液并入第三分液漏斗.精品文档中。4、LC-MS/MS分析条件的选择和优化，重点：缓冲溶液和流动相；样品预处理LC-MS/MS分析条件的选择和优化(1 ）接口的选择：ESI 适合于中等极性到强极性的化合物分子， 特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质） 。 APCI 不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。(2 ）正、负离子模式的选择：选择的一般原则为：正离子模式：适合于碱性样品，可

30、用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式(3 ）流动相的选择A）常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH 值。B） LC-MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须l mmol/L （盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器），含甲酸（或乙酸）2，含三氟乙酸0.5 ，含三乙胺l ，含醋酸

31、铵 1050 mmol/L 。C）送样前摸好LC 条件，可基本分离，缓冲体系符合MS要求。(4 ）注意事项：A）硫酸盐、磷酸盐和硼酸盐等非挥发性缓冲剂，需用挥发性缓冲剂，如乙酸铵、甲酸铵、甲酸、乙酸、氨水等代替。B） pH 值，当用挥发性酸、碱，如甲酸、乙酸和氨水等代替非挥发性酸、碱时， pH 值通常应保持不变。C）有机溶剂，大多数 HPLC用的溶剂，尤其是 RPLC， HILIC 流动相与 MS相匹配(5 ）流量和色谱柱的选择：A）不加热ESI 的最佳流速是1 50 L/min ，应用 4.6 mm 内径 LC 柱时要求柱后分流，目前大多采用l 2.1 mm内径的微柱， ESI 源最高允许l

32、 mL/min ，建议使用200 400 L/min 。B） APCI 的最佳流速是l mL/min ，常规直径4.6mm柱最合适。C）为了提高分析效率，常采用100 mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离），这对于大批量定量分析可以节省大量的时间(6 ）辅助气体流量和温度的选择：A）雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。B）操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20 左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解

33、。C）选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成， 有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。LC-MS/MS分析样品的预处理(1 ）进行样品预处理的必要性：A）从保护仪器角度出发，防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰。B）要求获得最佳的分析结果，从ESI 电离的过程分析：ESI 电荷是在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面存在竞争，不挥发物（如磷酸盐等）防碍带电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态，增加电荷中和的可能。(2 ）LC-MS/MS分析样品预处理的方法：A）超滤 B）溶剂萃取 / 去盐 C）固相萃取D）灌注（ Pe

34、rfusion）净化 / 去盐 E）色谱分离：反相色谱分离；亲和技术.精品文档分离 F）甲醇或乙腈沉淀蛋白G）酸水解，酶解牛奶中氯霉素类多残留的GC测定方法中，衍生化的作用；以间硝基氯霉素作内标物。牛奶样品用乙腈提取 , 离心 , 上清液浓缩至干 , 用水溶解残余物 , 过 C18 固相萃取柱 , 用甲醇 - 水 (60+40) 溶液洗脱 , 洗脱液挥发至干 , 用 N,O- 双 ( 三甲基硅 ) 三氟乙酰胺 (BSTFA)- 三甲基氯硅烷 (TMCS)(99+1) 试剂衍生化 , 加人甲苯和水 , 终止衍生反应 , 离心 , 有机相进样分析 , 色谱柱为 OV-1石英毛细管柱 (30m 0.

35、25mm), 载气为氦气 , 电子捕获检测器检测 ,可检测到牛奶中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量5g/kg猪组织中盐酸克伦特罗的检验ELISA 法，原理、操作及关键步骤基本原理： 微孔板包被有针对克伦特罗IgG 的抗抗体；加入克伦特罗抗体，经过温育和洗涤后；加入酶标记物、标准或样品溶液，克伦特罗与酶标记物竞争与抗体结合；没有连接的克伦特罗酶标记物在被洗涤除去；加入酶底物和发色剂并且温育，结合的酶标记物将无色的发色剂为蓝色的产物，加入反应终止液使颜色有蓝转变为黄色。在 450nm处比色测定。操作及关键步骤：(1 ）试剂盒的选择和准备固相载体：吸附性能，孔底透明度，板、孔性能差异；包被物：纯度；

36、储存条件： 2-8 ；室温平衡：试验用试剂应提前1-2h 从冰箱中取出，待温度与室温平衡后使用；及时保存：试剂完毕后不需用的部分应及时放回冰箱保存。(2 ）试样的处理尽可能使用新鲜样本；进行必要的前处理。加样加样前样本必须混合均匀； 加在板孔底部， 避免加在孔壁上部；不可溅出，不可产生气泡；每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染；加酶结合物和底物时可用定量多道加液器。(4 ）温育温育前必须震动混匀，但不可溅出；温育的温度和时间应按规定力求准确；温育必须避光。(5 ）洗涤清洗必须彻底；避免出现板孔干燥；反转倾空微孔板要迅速，避免清洗液混合。第四章食品中有害金属检测1、微波消解原理、方法及优点（1

37、）原理： 当微波通过试样时，极性分子随微波频率快速变换取向，2450MHz的微波，分子每秒钟变换方向2.45109 次，分子来回转动，与周围分子相互碰撞摩擦，分子的总能量增加，使试样温度急剧上升。同时，试液中的带电粒子（离子、水合离子等）在交变的电磁场中，受电场力的作用而来回迁移运动，也会与临近分子撞击，使得试样温度升高。（2) 方法： 食品样品的微波消解一般为取0.1 0.5g 样品，加入 58mL HNO3和 0 2mLH2O2选取适当的温度和压力参数，一般消化时间为10-40min 。（3）优点 :密闭微波消解可通过提高温度压力协助反应，使反应物在需要的特定温度下发生快速分解，减少分解所

38、需的.精品文档时间，提高工作效率，对传统方法这是不可能的。挥发元素如： As， Hg 等可以被保留在溶液中，防止挥发造成结果的偏差和对环境的污染。同时也使操作人员避免接触酸雾和有害的气体。由于微波消解试剂用量少，且无环境对样品的污染，因此有较低的空白样品的分解可以进行的更精确、彻底。能够实现从功率选择到消解反应的自动控制，避免了人为操作产生的错误和误差。通过温度、压力参数的控制可以保证消解的质量，保证反应完全一致的平行性和重复性2、原子荧光的类型，原子荧光光谱（AFS）原理、氢化物反应种类；氢化物原子荧光的干扰及消除方法；计算1）原子荧光的类型 ：共振荧光： 激发和去激发过程中涉及的上下能级相

39、同，即吸收和发射波长相同。直跃线荧光 ：激发和去激发过程中涉及的上能级相同。阶跃线荧光：激发和去激发过程中涉及的上能级不同。敏化荧光： 受激发的原子与另一种原子碰撞时，把激发能传递给另一个原子使其激发，后者再从辐射形式去激发而发射荧光即为敏化荧光。多光子荧光： 两个或以上的光子共同使原子到达激发态，然后发射一个光子再返回到基态所发射的荧光（ 2）原子荧光光谱（ AFS）原理：利用硼氢化钾或硼氢化钠作为还原剂，将样品溶液中的待分析元素还原为挥发性共价气态氢化物( 或原子蒸汽 ) ，然后借助载气将其导入原子化器, 在氩氢火焰中原子化而形成基态原子。基态原子吸收光源的能量而变成激发态；激发态原子在去

40、活化过程中将吸收的能量以荧光的形式释放出来,此荧光信号的强弱与样品中待测元素的含量成线性关系 , 因此通过测量荧光强度就可以确定样品中被测元素的含量。（ 3）氢化物反应种类金属酸还原体系（Marsh 反应）Zn+2HCL- ZnCl2+2HnH +Mm+-MHn+H2 缺点：能发生氢化物的元素较少；反应速度慢大约需要10 分钟；干扰较为严重。硼氢化钠酸还原体系酸化过的样品溶液中的砷、铅、锑、硒等元素与还原剂（一般为硼氢化钾或钠）反应在氢化物发生系统中生成氢化物。NaBH4+3H2O+H+=H3BO3+Na+8H*+Em+=EHn+H2(气体）式中 Em+代表待测元素，EHn为气态氢化物该体系克

41、服或大大减少了金属- 酸还原体系的缺点，在还原能力、反应速度、自动化操作、抗干扰程度以及适用的元素数目等诸多方面表现出极大的优越性碱性体系：在碱性试样底液中引入NaBH4和酸进行氢化反应. 在 NaOH强碱性介质中氢化元素形成可溶性含氧酸盐，可消除铁、铂、铜族元素的化学干扰。电化学方法在 5%KOH碱性介质中，用电解法在铂电极上还原砷和锡，优点是空白低，选择性好4）氢化物原子荧光的干扰及消除方法氢化物原子荧光的干扰(a ）液相发生在氢化物产生过程中，样品溶液中干扰元素优先反应，或形成络合物以及金属吸附被测元素的氢化物，消耗还原剂。气相 - 氢化物传输过程或原子化过程中的干扰，消耗氢基，降低被测

42、元素的原子化效率，因为在氢化物的解离过程中需要大量氢基参与反应。元素价态、共存的离子、样品介质和酸度、还原剂类型及用量等都可能带来干扰。主要有介质酸度干扰、氧化还原体系干扰、重金属干扰和易形成氢化物元素的干扰。.精品文档干扰消除选择合适介质和酸度，防止产生氧化性气体和固态氢化物或难溶的化合物，有些元素对酸度要求很苛刻，例如锡和铅、锗，过高过低都影响氢化物的产生；选择还原剂用量，减少金属离子被还原；加入掩蔽剂，例如硫脲、碘化钾、草酸等，对共存的干扰离子进行掩蔽，防止生成难溶化合物；(d) 预还原或氧化，氢化物的发生效率与价态有关，加入抗坏血酸，可使5 价砷还原成3 价，测量Pb 时加入铁氰化钾则

43、是先把2 价氧化成4 价，提高氢化物的产生效率；还有一些其它方法，应根据样品基体来选择合适的办法。(5) 计算：测定原子荧光的强度即可求得待测样品中该元素的含量。If = Ia If= k C式中： If 荧光强度 为荧光量子效率Ia吸收光的强度上述公式仅仅适用于低浓度的原子荧光分析。随着原子浓度的增加，由于谱线展宽效应、自吸、散射等因素的影响会使得曲线出现弯曲。3、砷的测定 - 银盐法原理，要求化学反应式表示含砷的样品经湿法消化后，其余砷全部转化成五价砷（ 1）消化2 As + 3 H2SO4 As2O3 +3 SO2 +3H2O3 As + 5 HNO3 + 2H2O 3H3AsO4 +5

44、NO3 As2O3 +4 HNO3 +7H2O 6H3AsO4 +4NO标准砷溶液： 1 g /mL(2) 还原 ( 15min )H3AsO4 +2KI +2HCl H3AsO3 +I2 +2KClH3AsO4 +SnCl2 +2HCl H3AsO3+ SnCl4+H2O(3) 显色（ 40min)H3AsO3 +3Zn +6HCl AsH3 +3ZnCl2 +3 H2OAsH3 + Ag(DDTC ) Ag ( 胶体，黄棕色）+ As (DDTC) +3HDDTC为使平衡向右进行，在Ag(DDTC ）中加入有机碱HDDTCNR3 (NR3H)(DDTC)4、F-730 测汞仪测定原理汞的空

45、心阴极等产生的特征谱线，当循环泵将汞蒸汽带入气路时，汞蒸汽对汞的特征谱线发生吸收作用，吸收程度与汞蒸汽浓度有关，浓度越大，吸收越多。基态汞原子吸收汞的特征谱线激发态（不稳定）释放 2537A谱线荧光粉屏 6000A的红光 CdS 光敏电阻转化成电信号电气指示系统指示其吸光度。这样吸光度可测且在一定浓度范围内与浓度成线性关系。第五章 食品添加剂及非法添加物检测1、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾结构式，化学名称及溶解特性；比较高效液相色谱法和气相色谱法测定，样品前处理方法不同之处，为什么？苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾结构式，化学名称及溶解特性；（ ppt 上没有，搜索维基百科）苯甲酸 ：

46、又称安息香酸，结构式6 5oCH COOH，无色透明固体，可溶于25C 热水 3.4g/L, 可溶于甲醇、乙醚苯甲酸钠 ：又称苯酸钠、安息香酸钠、苯甲酸钠盐，分子结构C H COONa，是无色或带苯甲酸气味，易燃，低毒，味65甜涩而有收敛性。可溶于水，水溶液呈碱性，也溶于甘油、甲醇、乙醇。山梨酸 ：IUPAC名（ 2E，4E）-2,4- 己二烯酸，结构式 CH2CH=CHCH=CHCOOH，为无色针状结晶粉末，无臭或微带刺激性臭味，耐光、耐热性好，在140Co 下加热 3h 无变化，长期暴露在空气中则被氧化而变色。山梨酸难溶于水，溶于乙.精品文档醇、乙醚、丙二醇、无水乙醇、花生油、丙酮和甘油山

47、梨酸钾 ：又称 2,4- 己二烯酸钾， BB粉，无色或白色至浅黄色鳞片状结晶、结晶状粉末或颗粒。无臭或稍有臭味。在空气中不稳定，长时间放置时吸湿并氧化分析而着色。常温下密封保存不会分解。易溶于水，基本无毒。比较高效液相色谱法和气相色谱法测定，样品前处理方法，为什么？高效液相色谱：原理： (ppt4)试样加温除去二氧化碳和乙醇，调 pH 至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。试样处理 ： (ppt7)汽水：称取5.00-10.00g试样，放入小烧杯中, 微温搅拌除去二氧化碳，用氨水(1 十 1) 调 pH约 7。加水定容至10mL-20mL，经滤

48、膜 (0.45um) 过滤。果汁类： 称取 5.00-10.00g 试样，用氨水 (1 十 1) 调 pH 约 7，加水定容至适当体积， 离心沉淀， 上清液经 0.45um 滤膜过滤。配制酒类：称取10.00g 试样，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水(1 十 1) 调 pH 约 7，加水定容至适当体积，经0.45um 滤膜过滤。气相色谱法 ：原理： (ppt10)试样酸化后，用乙醚提取山梨酸、苯甲酸，用附氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，标准系列比较定量。试样提取 ：（ ppt12 ）称取 2.50g 事先混合均匀的试样，置于25mL带塞量筒中，加0.5mL 盐酸 (1+1)

49、酸化，用15、 10 mL 乙醚提取两次，每次振摇1min，将上层乙醚提取波吸入另一个25mL带塞量筒中， 合并乙醚提取液。用 3mL氯化钠酸性溶液(40 g L) 洗涤两次，静止15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。准确吸取5mL乙醚提取液于5mL带塞刻度试管中，置40水浴上挥干，加入2mL石油醚 - 乙醚 (3+1) 混合溶剂溶解残渣，备用。苯甲酸和山梨酸测定- 薄层层析法，样品提取酸化的目的是什么？样品中如含有二氧化碳、酒精时应如何处理？薄层层析法 ：步骤 ：样品处理点样展开显色定性或半定量（ppt17 ）操作流程图 ： 2.5g 样品于25m

50、L具塞量筒加0.5mL 盐酸用15mL乙醚萃取，振摇1min用 10mL乙醚萃取合并两次萃取液于另一25ml 具塞量筒 NaCl 洗涤两次静止10min 通过无水NaSO4层过滤于25mL容量瓶加乙醚定容至25mL。吸取10.0mL 乙醚提取液分现将置于10mL 具塞离心管中40水浴上挥干加0.1mL 乙醇溶解残渣备用。（ ppt19 、 20）酸化的目的：样品酸化处理的目的是使苯甲酸钠、山梨酸钾转化为苯甲酸或山梨酸，再用乙醚提取。（书 P153）样品中如含有二氧化碳、酒精时应先加热除去。（书 P153）PPT19补充问题： 富含脂肪和蛋白质的样品应如何处理？富含脂肪和蛋白质的样品应除去脂肪和

51、蛋白质，以防用乙醚萃取时发生乳化。（ P153）加入酸性氯化钠溶液和无水硫酸钠使其盐析后再离心分离。（ P152）2、 食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法（GB/T19681 2005）样品的提取方法；柱层析的作用；流动相；定量计算超声波提取优点；超声波提取原理；样品提取方法：将液体、浆状样品混合均匀，固体样品磨细后用正己烷提取、过滤，必要时加入无水硫酸钠脱水后稍加温溶解，用旋转蒸发仪蒸发浓缩，然后慢慢加入氧化铝层析柱中萃取净化后用丙酮转移定容待测。（ ppt47 ）柱层析的作用：根据混合样品中不同成分在层析液中的溶解扩散速度之间的差异，将苏丹红从物质中分离出来，以方便对目标物质下一步骤

52、的测定。 （书、 ppt 都无，自己理解的）流动相：溶剂A 0.1% 甲酸的水溶液- 乙腈（ 85:15 ）；溶剂 B 0.1% 甲酸的乙腈溶液- 丙酮（ 80:20 ）.精品文档超声波提取原理：超声波提取，是基于超声波的特殊物理性质。主要是主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固- 液萃取分离。（ ppt53 、54）（ 1）加速介质质点运动。高于 20 KHz 声波频率的超声波的连续介质（例如水）中传播时，根据惠更斯波动原理，在其传播的波阵面上将引起介质质点（包括药材重要有效成分的质点）的运动，使介质质点运动获得巨大的加速度和动能。质点的加速度

53、经计算一般可达重力加速度的二千倍以上。由于介质质点将超声波能量作用于药材中药效成分质点上而使之获得巨大的加速度和动能，迅速逸出药材基体而游离于水中。（ 2）空化作用 。超声波在液体介质中传播产生特殊的“空化效应”，“空化效应”不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴并不断“爆破”产生微观上的强大冲击波作用在中药 材上，使其中药材成分物质被“轰击”逸出，并使得药材基体被不断剥蚀，其中不属于植物结构的药效成分不断被分离出来。加速植物有效成份的浸出提取。（ 3）超声波的振动匀化（ Sonication）使样品介质内各点受到的作用一致，使整个样品萃取更均匀。综上所述，中药材中的药效物质在超声波场作

54、用下不但作为介质质点获得自身的巨大加速度和动能，而且通过“空化效应”获得强大的外力冲击，所以能高效率并充分分离出来。超声波提取优点： （ ppt55 、 56）1）提取效率高 ：超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，使中药有效成分提取更充分，提取率比传统工艺显著提高达 50 500%；（ 2）提取时间短 ：超声波强化中药提取通常在24-40 分钟即可获得最佳提取率，提取时间较传统方法大大缩短2/3以上， 药材原材料处理量大；3）提取温度低 ：超声提取中药材的最佳温度在 40 60，对遇热不稳定、 易水解或氧化的药材中有效成分具有保护作用，同时大大节能能耗；4）适应性广 ：超声提取中

55、药材不受成分极性、 分子量大小的限制， 适用于绝大多数种类中药材和各类成分的提取；5）提取药液杂质少，有效成分易于分离、纯化；6）提取工艺运行成本低，综合经济效益显著；7）操作简单易行，设备维护、保养方便。提取率提高 50%500%，提取时间（分钟）缩短 2/3 以上，提取温度为4060，保护有效成份。3、吊白块 - “甲醛次硫酸氢钠”分光光度法测定原理、方法及计算原理 ：吊白块在酸性条件下可分解出甲醛，甲醛沸点很低，样品进行水蒸气蒸馏，是甲醛馏出后在与乙酰丙酮作用，生成黄色的二乙酰基二氢吡啶，根据颜色深浅比色定量。（书 P177）方法： 取粉碎均匀的样品5g, 加水 50 mL,在超声波中提

56、取15 min, 并随时搅拌， 取出后， 加入 10硫酸锌溶液5ml及 4氢氧化钠溶液3 mL，混匀，静置10min，以 3000r min，离心10min，取上清液9ml 于 25ml 容量瓶中 . 加入1.0mL 乙酰丙酮溶液, 混匀，于沸水浴加热3min 取出，用自来水冷却至室温，立即在415nm波长进行比色测定，以蒸馏水调零，以标准曲线计算样品溶液中甲醛的浓度，并技公式计算出样品中吊白块的含量。（ ppt62 ）4、艾杰尔三聚氰胺HPLC-MS，样品的提取，PCX 小柱净化，氮吹仪作用样品制备： 准确称取粉碎后的样品2.0 至 50mL塑料离心管中，加入1%三氯乙酸溶液15mL，超声提

57、取30min 后，以 5000r/min离心 10min，将上清液经滤纸过滤后转入另一50mL离心管中。分别用10mL甲醇、 10mL水活化 SPE柱，将样品溶液上柱，在用10ml 水、 10ml 甲醇洗涤 SPE柱，弃去洗脱液。抽干SPE柱后用 5%氨水 - 甲醇溶液（ 5： 95）15ml 洗脱，收集洗脱液， 将洗脱液与40oC 水浴旋转蒸发至近干，氮气吹干。 用甲醇 - 水（ 2:8 ）定容至 1.0ml ，过 0.2m滤膜，待测。（书 P180）净化（ ppt68 ）： PCX小柱， 60mg 3mL：（ 1）活化及平衡：3mL甲醇， 3mL水（ 2）上样：加入提取液3mL（ 3）淋洗

58、： 3mL水； 3mL甲醇；弃去淋洗液并将小柱抽干（ 4）洗脱： 5mL 5氨化甲醇 (v v) 洗脱。 (5 氨化甲醇的配制：5mL氨水 5mL+95mL甲醇。（ 5）浓缩： 50，氮气吹干，20甲醇水定容至2mL。.精品文档氮吹仪的作用：用于吹干SPE 柱上的洗脱液，并且防止柱上的成分被氧化使得测量结果有偏差。（ ppt 、书都无，自己理解的）第六章食品中天然毒素检测技术免疫亲和净化的原理、特点（ppt8 ）原理 ：免疫亲和净化法结合了单克隆抗体技术和亲和柱技术，利用抗原- 抗体免疫反应的原理，选择性吸附提取液中的毒素，以达到分离净化的目的特点优点 ：特异性强、净化效果好缺点 ： 1）耗时

59、、 2）用于单一毒素的测定、3）价格比较贵、保存需冷藏黄曲霉毒素测定（高压液相色谱、酶联免疫法、胶体金免疫层析法），重点：胶体金免疫层析法原理及结果判断方法高效液相色谱： （书 P196）基本原理：样品通过免疫亲和柱时，黄曲霉毒素M1被提取。亲和柱内含有的黄曲霉毒素M1 特异性单克隆抗体交联在固体支持物上，当样品通过亲和柱时，抗体选择性地与黄曲霉毒素M1（抗原）键合，形成抗体- 抗原复合体。用水洗柱出去主内杂质，然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1，收集洗脱液，用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M1含量。酶联免疫法定量检测（ppt19 ）（ 1）检测原理：检测的基础是

60、抗原抗体反应。微孔板包被有特殊的黄曲霉毒素M1 抗体。加入标准品或样品溶液和在洗涤步骤后加入的酶标记黄曲霉毒素M1 （酶连接物） 。游离的黄曲霉毒素M1 和酶连接物竞争抗体结合位点（竞争性酶联免疫分析） 。没有结合的酶连接物在洗涤步骤中被除去。在孔中加入底物/ 发色剂，结合的酶连接物将发色剂转化为蓝色。 加入反应终止液后颜色由蓝色转变为黄色。在 450 nm处测量，吸光度值与样品中的黄曲霉毒素M1 浓度成反比。2） ELISA 试剂盒特点（ ppt25 ）优点 : 简单，灵敏 , 可定量，价格低廉，使用安全缺点 : 极个别的假阳性（假阴性）结果，蛋白，脂肪，酶，pH，操作等影响抗原抗体反应3）